2021 Fiscal Year Research-status Report
Environmental pollutant degradation system using dye-decolorizing peroxidase
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20K05700
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
内田 毅 北海道大学, 理学研究院, 准教授 (30343742)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 環境浄化 / 色素分解 / 酵素 / ヘム / 過酸化水素 / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DyP (Dye-decolorizing peroxidase) はヘムを含むペルオキシダーゼという酵素タンパク質の一種で、過酸化水素を利用し、アントラキノン系の色素を分解する酵素であることから、環境浄化酵素としての利用が期待されている。しかし、微生物やカビなどの一部に存在するタンパク質であるにもかかわらず、それらの生育条件とは離れたpH 4程度の酸性条件で活性が高く、中性付近ではほとんど活性がないという特徴が、環境浄化酵素としての実用化へのハードルとなっていた。そこで、反応機構を明らかにすることにより、pH依存性を決定している因子を明らかにし、アミノ酸置換を導入することにより、中性pHで活性を持たせることに成功した。試験管内の反応では中性で色素を分解可能になったため、これを大腸菌に発現させ、大腸菌を培養しながら、溶液内の色素を分解することを試みた。しかし、予想外に活性は著しく低く、環境浄化酵素として利用することでできなかった。原因を検討した結果、菌体内で発現させると活性中心であるヘムと結合していないことがわかった。ヘモグロビンなど多くのヘムタンパク質ではヘムはタンパク質と配位結合しているため、大腸菌内で利用しようとするとヘムを含まない可能性がある。そこで、タンパク質とヘムが共有結合しているシトクロムcにDyP活性を付与することを試みた。
はじめに天然型のシトクロムcのDyP活性を測定したところ、DyPの1/2程度の活性であることがわかった。次に、DyPで明らかにした反応機構をもとにシトクロムcに色素分解に必要なアミノ酸残基を導入することにより、天然型のシトクロムcの80倍の活性をもつ変異体シトクロムcを作成した。また、至適pHは8.0付近であったことから、試験管レベルではあるが、環境浄化酵素としての利用が期待できるものの作成に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では1. 至適pHの中性への変換を、2. 基質結合部位の改変による基質の拡張、3. 無機材料への固定化による安定性の向上、4. DyPを強制発現させた微生物による環境浄化、という手順により、アントラキノン系の合成色素の分解に加え、構造が類似したダイオキシンや抗生物質などの排水中の有害物質を安価で効率的に分解する環境浄化システムをタンパク質レベルと微生物レベルの両面のアプローチから構築することを目的としていた。
二年目の昨年度はヘムとタンパク質がチオエーテル結合により結ばれているシトクロムcに色素分解活性を持たせることを試みた。そのために、①ヘムの配位子の一つであるメチオニン80をアラニンまたはバリンに置換し、ヘムが過酸化水素と反応するための空隙を作る、②基質の結合部位に疎水性の残基であるトリプトファンを導入し、基質の親和性を上昇させる、③過酸化水素との反応性を上げるため、ヘムの配位子であるヒスチジンの近くにアスパラギン酸を導入し、水素結合を形成させる。
以上の三点の設計指針に基づき、変異を導入し、活性を比較した。その結果、③の水素結合の導入が最も効果的であり、グリシン29をアスパラギン酸に置換することにより触媒効率を80倍に増加した変異体の作成に成功した。以上の結果、計画通り順調に研究は進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までの研究の結果、大腸菌内でヘムと共有結合を形成して発現するシトクロムcに改変を加えることにより、活性中心を含んで発現し、中性pHで活性があるタンパク質酵素の作成に成功した。最終年度は当初計画の「4. DyPを強制発現させた微生物による環境浄化」に取り組む。大腸菌の基質の取り込み効率を考慮すると細胞質より、ペリプラズム空間で反応させる方が効率的だと考えられる。そこで、シトクロムcにシグナル配列を付加し、ペリプラズム空間で発現させる。色素を加えた培地で改変したシトクロムcを発現させ、大腸菌を培養しながら色素を分解させる。現在使用している発現ベクターはIPTGにより発現誘導するタイプのものであるが、これをpUC19などの常時タンパク質を発現するタイプに変更し、常に大腸菌内で発現するようにする。
また、色素分解反応にはヘムを活性型に変換するために過酸化水素の添加が必要である。過酸化水素は活性酸素であるため有毒であるが、呼吸鎖で発生する過酸化水素がペリプラズム空隙に漏れ出すことが知られている。これを反応に利用する予定であるが、生体内には過酸化水素除去酵素が存在するので、利用できる過酸化水素の量が不十分であるかもしれない。その場合、活性酸素を発生させる試薬として知られパラコートを溶液に添加して、活性を調べる。一番の懸念は大腸菌が基質である色素を十分に取り込めない可能性がある点である。これが問題の場合、色素と同様に疎水性の分子であるヘムを取り込むトランスポーターの遺伝子を共発現し、基質の取り込みを増加させる。以上の手順により、大腸菌を培養しながら環境汚染物質を分解するシステムの構築を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究は順調に遂行されており、予算も適切に消費しているが、基金であることから年度末に不必要に消費せず、次年度に繰り越したためである。
次年度使用額が計上されているが、次年度の交付額と合わせ、大腸菌培養用の試薬費の一部として使用する予定である。
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Research Products
(5 results)
