2020 Fiscal Year Research-status Report
環状リガンドの配座制御を基盤としたタンパク質局在の光制御法の開発
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20K05702
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
小和田 俊行 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (40584397)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | フォトクロミック / 光応答性分子 / 細胞 / 蛋白質二量化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質が細胞内で機能を発現する時には、例えば細胞質から核内へと局在を変化させる。したがって、光を用いて可逆的にタンパク質局在を操作できれば、タンパク質や細胞の機能を任意のタイミングで制御可能だと考えられる。本研究ではタグタンパク質を介した細胞内タンパク質局在の光制御法の確立を目指している。特に、光応答性部位を組み込んだ環状小分子リガンドを利用することで、光照射に伴う分子構造変化の前後でタンパク質に対する親和性を劇的に変化させることが可能であると期待される。本研究で開発する光応答性環状リガンドに基づく細胞内タンパク質局在の光制御法は、細胞内タンパク質の機能解明に貢献できる要素技術となることが期待される。
当該年度は、（１）光応答性環状リガンドの有機合成と（２）蛍光タンパク質融合タグタンパク質を安定発現する細胞株の樹立、に取り組んだ。
（１）光応答性タンパク質二量化剤を合成するために、既報に従いタグタンパク質の一種であるHaloTagのリガンドを合成した。一方で、環状リガンドについても合成を進めており、残り５段階の合成で目的物が得られる状態である。合成が完了次第、光異性化特性ならびにタグタンパク質への結合能の評価を行う予定である。
（２）ヒト由来細胞内に蛍光タンパク質とタグタンパク質の融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を樹立した。具体的には、HeLa細胞に対して緑色蛍光タンパク質（EGFP）とタグタンパク質が融合発現するベクターをトランスフェクションし、薬剤耐性を有する細胞を選択するためにG418を添加して培養を続けることで安定発現株を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年度初めは新型コロナウイルスの感染拡大により研究室内での実験活動に制限が出てしまい、思うように研究を進めることが困難であった。幸い早期に実験可能な状態に戻れたため、当初計画していたリガンド合成に取り掛かり、安定発現細胞株を樹立することができた。引き続き研究を進めることで、実施期間内に本研究課題の達成が十分可能であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題の達成には、目的とする光応答性環状リガンドの合成が必須であるため、今後はリガンド合成について特に注力して研究を進めていく。早期に合成を完了させ、光照射による構造変化の評価に取り組む。具体的には、様々な波長の光を照射し、構造変化の波長依存性を吸光高度計ならびにHPLCを用いて評価する。さらに、光照射によるタグタンパク質への結合能の変化を、蛍光偏向解消法を用いて評価する。本実験のために、蛍光標識した光応答性環状リガンドも合成する予定である。
試験管内での物性評価が完了次第、培養細胞を用いた実験に移行する。細胞内に環状リガンドが結合するタグタンパク質とHaloTagをいずれも蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させ、タンパク質局在の変化からリガンドの性能を評価する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの感染拡大防止措置により実験遂行に多少の制限が生じた。そのため、本年度購入予定であった試薬類を次年度に購入する予定である。
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