2020 Fiscal Year Research-status Report

病原性細菌が嫌気的にヘムを開環分解して生存に必須の鉄を取り出す機構の解明

Research Project

Project/Area Number	20K05708
Research Institution	Yamaguchi University
Principal Investigator	小崎紳一山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (40280581)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	樋口恒彦名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 教授 (50173159) 木股洋子山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (60255429) 永野真吾鳥取大学, 工学研究科, 教授 (60286440)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	ヘム
Outline of Annual Research Achievements	鉄は呼吸によるエネルギー生産に必須の金属イオンであるため、生物は様々な鉄獲得機構を進化させてきた。病原性細菌も例外ではなく、主たる鉄源は感染宿主の赤血球に含まれるヘモグロビン(Hb)である。一般的に、グラム陰性細菌は、① 溶血後Hbから遊離したヘムをヘモフォアHasAによって外膜受容体HasRまで輸送し　② 外膜・内膜を通し　③ 細胞質で分解することで生存に必須の鉄を抽出する。私達はこれまで、Pseudomonas aeruginosa（グラム陰性好気性細菌　日和見感染の原因菌の一種で、皮膚、肺・気管支の炎症の原因細菌）Yersinia pseudotuberculosis（グラム陰性通性嫌気性細菌　胃腸炎の原因細菌）Eikenella corrodens（グラム陰性通性嫌気性細菌　歯周病の原因細菌）Porphyromonas gingivalis（グラム陰性偏性嫌気性細菌　歯周病の原因細菌）を研究材料にして「ヘムの細菌内への輸送」や「ヘムを分解して鉄の抽出」を行うタンパク・酵素の機能解析を実施してきた。そして、細菌は生育環境に応じて実に多様な鉄獲得のための仕組みを構築していることを明らかにした。さらに、ヘムの輸送を阻害することで病原性細菌の生育を阻害できることも実証した。しかし、偏性・通性嫌気性細菌が嫌気下で酸素非依存的にヘムを分解する機構については未解明である。嫌気的ヘム分解経路を解明し、その知見をもとにして阻害剤をデザイン・合成して細菌の生育抑制することが本研究の目的である。本研究を通して歯周病や胃腸炎など病原性細菌による感染症対策、健康的な生活の実現に寄与することを目標とする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和２年度の研究では、第一に、偏性・通性嫌気性細菌において酸素非依存的にヘムを分解する役割を担っていると考えられる酵素の発現と精製に成功し、現在、この酵素が基質であるヘムとの結合能を持っているかどうか、酸素非依存的なヘム分解活性を持っているかどうかなどについて検証している。第二に、嫌気下では酸素分子の代わりにメチルラジカルを用いてヘムの開環反応が進行しているのではないかという仮説に基づいて、ヘムや類似するテトラピロールと化学的に生成したメチルラジカルとの反応を行い、生成物の同定に取り組んでいる。嫌気的なヘム分解物には、好気的なヘム分解物と異なり酸素原子が付加されておらず疎水性が高いと推測される。分解物の菌体外への排出に関与する可能性のある配糖化酵素についての予備実験を開始した。
Strategy for Future Research Activity	これまでに得られた知見をもとに、(1) 化学的に生成したメチルラジカルとヘムとの反応で得られた分解物を同定すること (2) 嫌気的ヘム分解酵素に基質としてヘムとメチルラジカル源のS-adenosyl methionine (SAM)を与えることでヘムの分解が起こるか、起こるならば、分解物が何であるかを突き止めること (3) 嫌気的ヘム分解酵素の活性中心（基質結合部位）の構造を明らかにすることに取り組む。(1)~(3)の結果を総合して嫌気下での酸素非依存的なヘム分解反応のメカニズムを明らかにし、この反応の阻害剤の探索を開始する。また、疎水性が高いと推測される嫌気下でのヘム分解物の菌体外への排出に関与する可能性のある酵素・タンパクの探索も行う。
Causes of Carryover	コロナ禍のため、令和2年度に予定していた、学会参加、導入する機器に変更が生じたため、次年度使用額が生じた。 2021年度以降分と合わせて、嫌気チャンバーを購入し、嫌気培養、嫌気反応の実験に取り組む予定である。