2020 Fiscal Year Research-status Report
二核銅酵素チロシナーゼの成熟化と反応機構の解明と新規阻害剤の戦略的開発
| Project/Area Number |
20K05715
|
|---|
| Research Institution | Yasuda Women's University |
|---|
Principal Investigator |
的場 康幸 安田女子大学, 薬学部, 准教授 (90363051)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | チロシナーゼ / 銅 / X線結晶構造解析 / 反応機構 / 成熟化 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
申請者はこれまでに、放線菌由来チロシナーゼ(Ty)とその金属シャペロンであるキャディー(Cad)からなる複合体のX線結晶構造解析に成功した。また、この複合体を用い、Tyの活性中心へ銅イオンが輸送される機構を明らかにした。さらに、Tyの活性中心近傍に存在するCadのTyr98残基が酸化反応を受けることを発見し、その触媒機構を時間分解X線結晶構造解析で明らかにした。ただし、Tyの成熟化と反応機構には、今なお不明な点が数多く残されている。
海外グループの研究により、活性中心近傍に存在する水分子がTy活性に重要であると指摘されている。また、CadのTyr98残基に対するTyの反応機構解析からも、この水分子が水素結合ネットワークを介して触媒塩基の活性化に寄与していることが示唆された。この水分子の塩基性を変化させることを目的として、水分子と水素結合するN191残基をグリシンに置換した。その結果、本変異体はドーパミンを酸化するカテコラーゼ活性を有していたが、チラミンを酸化するフェノラーゼ活性は極めて弱かった。N191G変異型TyとCadの複合体結晶を作成し、Tyr98残基に対する反応機構を解析したところ、変異型複合体では、Cu(II)-ドーパセミキノン型中間体が観測されなかった。すなわち、Cu(II)-ドーパセミキノン型中間体の寿命延長が、フェノラーゼ活性に重要であると考えられた。
一方、別の海外グループの研究により、細胞内でTyは銅イオンよりも多く存在する亜鉛イオンと結合し、不活性状態になっていることが示唆されている。本年度は、野生型複合体の結晶にZn(II)を添加し、その構造を解析した。その結果、活性中心への取り込みが観測された。また、活性部位の構造はCu(I)と結合したデオキシ型の構造に類似しており、Cu(I)とZn(II)が正四面体型配位を好むことを反映していると考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Tyの反応機構において、Cu(II)-ドーパセミキノン型中間体の重要性を明らかにすることができたこと、および、Cadは銅イオンに特異的な金属シャペロンではなくZn(II)を輸送する能力があることを明らかにできたことの2点を考慮すると、順調に研究が進捗しているといえる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Tyの反応機構については、変異体としてはN191G変異体、基質としてはドーパミン・チラミンの組み合わせでしか考察しておらず、変異体の種類や基質の種類を増やし、検討を行う。また、Zn(II)存在下で、Ty・Cad複合体に銅イオンを添加し、亜鉛イオンが銅イオンに置換されるカイネティクスパラメーターを決定する。
|
Research Products
(3 results)
