Engineering fast maturing fluorescent proteins as improved reporter genes

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K05717
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 新野 祐介 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 研究員 (10584584)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 蛍光タンパク質 / レポーター遺伝子 / 蛍光イメージング / タンパク質工学

Outline of Annual Research Achievements

オワンクラゲ由来のGFPに代表される蛍光タンパク質は、遺伝子発現動態を調べるレポーター遺伝子として広く利用されているが、蛍光性の獲得には発色団形成のための時間を要する。そのため、三次構造へとフォールディングした時点で発光性を得るルシフェラーゼに比べ、追従性の低さが課題となる。
これまでに申請者は成熟の速い黄色蛍光タンパク質（YFP）Achillesを開発しているが、本課題ではさらなる早熟化とともに、複数の遺伝子発現動態を同時可視化するため、組み合わせて観察可能な早熟シアン色蛍光タンパク質（CFP）の開発を行った。(1) 発色団形成の律速となる酸化反応のより高速なAchilles変異体と、それよりもさらに早熟な新規CFPを大腸菌レベルでの模索・評価により見出した。哺乳類細胞においてもmRNAでの遺伝子導入をパルス的に行う実験系でその早熟性を評価した。(2) プロモーター領域の下流に強分解シグナルを融合した早熟蛍光タンパク質を配し、蛍光レポーターを構築した。NF-κβ活性レポーターのTNFα刺激に対する応答性など、その性能確認を行った。(3) Achilles変異体に酸化速度のみでなく光安定性の向上も見出し、さらに変異を加え、既報の最も光安定なYFPを超えてさらに光安定なYFPを副産物として創出した。(4) 同一ベクター上で、異なるプロモーター下にこれらの不安定化早熟YFP・CFPを配したデュアルレポーターを構築し、（発光レポーターでは不可能な）フローサイトメトリーによる個々の細胞における遺伝子発現二種の同時検出などを行った。
今後、遺伝子発現振動など上下動の激しい現象に対して、同一細胞内での複数同時可視化の応用を行っていく予定である。また、追従性の高い蛍光レポーターをより多色化する上で、本研究の開発スキームを活かすことができると考える。