2020 Fiscal Year Research-status Report

Epigenetic regulation of circadian rhythm in HepG2 cells

Research Project

Project/Area Number	20K05719
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	冨田辰之介国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (60415718)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	エピゲノム / HepG2
Outline of Annual Research Achievements	HepG2細胞において、時計遺伝子bmal1はサーカディアンリズムを刻まない事は知られていた。DNAメチル化阻害剤azaCを負荷することで、リズムを回復する可能性を見出した。先ず、この現象を再現的に得られる条件を見出すために、azaCの濃度や曝露する期間を様々に振って、再現的にその現象が見られ宇条件を検討した。その結果、azaCをsub microM オーダーの低い濃度で4週間以上の長期曝露をすることで、再現的にリズムを回復すること、およびその効果は濃度依存的であることを見出した。別発表で既に、DNAのメチル化、脱メチル化については、修飾される速度や乖離する速度が、遺伝子によって大きく異なる可能性を発表していたが、bmal1のリズム発現を抑制している因子は、徐々にメチレーションを解除することで、その抑制効果が解除されることを示すと考えている。また、azaCによって、アルブミンの発現も回復することが知られていたが、今回の検討でもアルブミンの発現を同時にqPCRで確認した。その結果、アルブミンの発現も増えていることが確認できた。次に、4週間azaC処理をしたHepG2細胞の中で、どの遺伝子発現が変化することで、bmal1遺伝子発現への影響を与えたのかについての推定を行う為に、同じ処理を行って、細胞からRNAを回収し、mRNAの発現量についてDNAマイクロアレイを用いた網羅的発現解析に供した。その結果、発現量が変化している遺伝子候補を複数見出した。これは、今後これらの遺伝子についてはqPCRなどを用いて定量的な解析を行い、直接間接を含めてどのようなネットワークでリズムが回復するようになったのかを解析するうえで端緒となる検討である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 再現的にリズムを発現する条件を見出したこと、また、その条件下で遺伝子の網羅的発現を行い、今後どの遺伝子発現を解析していくかについての方針を決めるうえで必要な成果を得られたと考えているから。
Strategy for Future Research Activity	網羅的発現解析によって上がってきた候補遺伝子について、qPCRなどを用いて発現変化を定量化する。複数の遺伝子が考えられるので、遺伝子のパスウェイなどを考えながら、メカニズムに迫っていく。
Causes of Carryover	旅費の使用がほとんどなかった点と、その他の費目で想定していた受託解析の費用が想定よりも安く済んだ点が乖離の主な理由です。次年度以降、消耗品の重点的な購入や更なる受託解析への使用などを考えています。