2020 Fiscal Year Research-status Report
葉酸代謝に関与するアルデヒド脱水素酵素のがん抑制機能の全容解明を目指して
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20K05731
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
佐々木 雅人 東北医科薬科大学, 薬学部, 准教授 (30396527)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 一男 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (70255123)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | がん代謝 / 活性酸素種 / エピジェネティクス / 翻訳後修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テトラヒドロ葉酸(THF)代謝は、核酸の合成やDNA・タンパク質のメチル化（エピジェネティック制御）に関与することから、抗がん剤の標的となっている。THF代謝系の酵素の一つであるALDH1L1、および、ALDH1L2による反応系が、近年、主要なNADPHの供給源であると判明し、活性酸素種(ROS)の制御の観点からも着目されている。ALDH1L1/2発現は多くの腫瘍組織・細胞株で減弱しており、これらががん抑制遺伝子である可能性を見出したが、その詳細なメカニズムや意義については不明な点が多い。従って、ALDH1L1/2発現・活性変動が、(1) THF代謝を含むグローバルな細胞内代謝、中でも、核酸合成やエピジェネティック制御異常をもたらすのか、それとも、(2) NADPH・ROS産生・制御異常をもたらすのかを明らかにすることを目的とする。また、(3) ALDH1L1/2の制御機構を解明することで、発がん・腫瘍進展を制御しえるか否かを明らかにし、新たな抗がん治療薬の開発へ応用する事を目的とする。
これまでにがん細胞株で、ALDH1L1/2野生型(WT)、並びに、酵素活性を欠く変異体(MT)を発現する安定発現株を樹立した。各WT、および、MT細胞のいずれにおいても、通常の培養条件下における増殖速度や細胞内NADPHレベル、並びに、ROS量には顕著な差は見られず、葉酸代謝拮抗剤などのストレス負荷条件下においても、顕著な差は見られなかった。一方、ヒストンH3の特定のリジン残基のメチル化状態に違いが見られ、エピジェネティックな影響が観察された。メタボローム解析では、THF代謝系とリンクしたアミノ酸代謝系に影響を及ぼすことが判明した。加えて、ALDH1L1/2 タンパク質では、ユビキチン修飾と推定される高分子量体が、ALDH1L1/2 MTタンパク質で、顕著に減少することを見出している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ALDH1L1/2 野生型(WT)、並びに、変異体(MT)を発現する安定発現株を作製した。それらを用いて、酸化ストレスや葉酸代謝拮抗剤などのストレス状況下における細胞増殖能や、NADPH定量、細胞内ROS量などの解析を行たところ、各WT、MT安定発現株において顕著な差は観察されなかった。THFはS-アデノシルメチオニン産生にも関与することから、エピジェネティック制御機構への関与について、ヒストンH3のメチル化状態を調べた。その結果、特定のリジン残基においてメチル化状態の変化が観測された。現在この変化が、細胞内S-アデノシルメチオニン産生量の変化の結果もたらされたものであるのか否かを検討している。
同時に、HuH-7安定細胞株を用いて、メタボローム解析を実施したところ、THF代謝にリンクするアミノ酸の代謝系が影響を受けていることが判明した。そこで、ALDH1L1/2発現レベルと、アミノ酸要求性との相関について検討を加えている。
ALDH1L1/2 タンパク質では、ユビキチン修飾と推定される高分子量体が、ウェスタンブロットで観察されるが、WTタンパク質と比較して、MTタンパク質ではその発現量が低いことを見出している。高分子量体であることから、ユビキチン修飾である可能性を想定し、解析を進めている。一方、ユビキチン修飾ではない可能性を示唆する結果も得られつつあるため、同時に、他の分子修飾機構についても解析を進めている。
遺伝子改変マウスを作製に関しては、作製準備を進めていたが、他の研究グループから欠損マウスの報告がなされてしまった。そのため、ノックインマウスにするべきかなどを思案中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞株を用いた解析は、エピジェネティックな変化がSAM依存性であるか否か、メチル化DNAへの影響等を検討し複数の細胞株においても同様の傾向を示すのかについて検討を加える。
メタボローム解析で見出された結果をもとに、ALDH1L1/2の発現レベルと代謝阻害剤感受性との相関を調査する。ALDH1L1/2発現は腫瘍のタイプにより減弱するパターンが異なる可能性があることから、本検討により、ALDH1L1/2発現を調べることで抗腫瘍薬選択の有効な指標を明示できると期待される。
がん細胞株を用いてがん進展への影響を、正常細胞を用いて発がんへの影響を検討する予定である。
ALDH1L1/2 タンパク質の高分子量体の解析は、ユビキチン修飾の可能性とその他の可能性を考慮しつつ、質量分析などで同定を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
2020年度に遺伝子改変マウスを作製する計画で準備を進めていたが、計画の見直しにより作製を保留したため次年度使用額が生じている。今後、マウス作製をどのように進めるかを思案し、準備を進めていく。
また、翻訳後修飾の解析や代謝変化などはオミクス解析を実施することも思案中であり、そちらの解析にも使用する予定である。
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