Molecular mechanism of reversible coaggregation of M-ficolin-C-reactive protein complex

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05739
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 谷生 道一 国立感染症研究所, 血液・安全性研究部, 主任研究官 (10416662)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: M-フィコリン / C反応性タンパク質 / 凝集 / 可逆的

Outline of Annual Research Achievements

M-フィコリンとC反応性タンパク質（CRP）は、ヒト血中に存在する病原体認識タンパク質である。本研究では、申請者が独自に発見した、M-フィコリン基質結合ドメイン（FD1）とCRPが、特定条件下で示す可逆的凝集現象について、その分子機構の解明を目指した。本研究期間の目的は、（１）凝集体におけるCRPおよびFD1の分子配置の解明、（２）CRP-FD1複合体および凝集体中のカルシウム結合部位および結合数の解明、（３）FD1を用いた新規CRP検査技術開発の分子基盤構築、の三つである。本年度は、CRP-FD1凝集形成の定量的検出法の確立、および種々の低分子化合物等の添加による凝集阻害の有無より、凝集形成の特異性解析を実施した。凝集検出法の確立では、これまで定性的にしか評価できなかった凝集現象の定量化を目指した。その結果、まだ再現性が安定しないものの、一般的な分光光度計プレートリーダーを用いた濁度測定により、96ウェルプレートを用いた多試料の経時変化解析法の確立に成功した。確立した凝集解析法を用いて、変異体FD1および種々の化合物の添加による、CRP-FD1凝集現象の変化を解析した結果、CRP-FD1凝集現象をほぼ100%阻害する低分子化合物を発見し、この凝集が特異的相互作用によって誘起されることが明らかとなった。また、CRP-FD1複合体中の各タンパク質は基質結合活性を有していること、およびCRP-FD1凝集形成には、少なくとも2種類の会合形式が存在することが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

緊急事態宣言等により、予定していた実験の一部が実施できなかったものの、CRP-FD1凝集形成の経時変化解析法の確立に成功し、その解析法を用いた変異体FD1を用いた凝集活性解析結果、および凝集を阻害する低分子化合物の発見により、研究計画時に想定していなかった、凝集形成の本質に関わると思われる知見が得られ、本研究期間の三つの目的全てに対する基礎的データが得られたため。

Strategy for Future Research Activity

本年度に得られた知見を基に、CRP-FD1凝集体の分子レベルにおける解析を行い、各タンパク質の分子配置を決定する。また確立した凝集活性解析法は、使用器具変更により再現性が得られないことがあったため、解析法の最適化も試みる。さらに、凝集体中の各タンパク質の基質結合活性の評価を試みる。また凝集機構を応用した、新規CRP検出法の開発基盤として、高凝集FD1変異体のスクリーニング探索を行う。

Causes of Carryover

緊急事態宣言等による試薬・器具等の納品遅延のため、年度内に購入できなかったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上し、必要な試薬・器具等を購入する予定である。