2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K05741
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
安野 理恵 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (30392674)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三谷 恭雄 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (10358103)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 生物発光 / ルシフェラーゼ / ゴカイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
発光ゴカイは鮮やかな青緑色（510nm）の発光液を海中に分泌する。1950年代にルシフェリン・ルシフェラーゼの発光機構を有することが示されたが、それ以降詳細な解析は進められていなかった。本研究では、その発光反応の分子機構を解明することを目的として、in vitroにおける発光反応の生化学的解析、ルシフェラーゼの結晶構造解析および組織化学的解析を進める。発光反応の解析のため、生体から抽出したルシフェリン溶液と動物培養細胞で発現させたルシフェラーゼタンパク質を用いてin vitro発光系を構築した。発光反応のpH依存性や温度依存性、塩濃度依存性など、ゴカイ発光反応の生化学的特性の解析を進めている。一方、実用化技術への展開を視野にいれた際、現状、ルシフェリンやルシフェラーゼタンパク質の安定性が悪く発光反応の再現性が不安定であるという課題もあり、今後これら課題の改善方法の検討を進める必要がある。次に、ゴカイルシフェラーゼタンパク質の特異抗体の作成および結晶構造解析に供試するために、タンパク質の大量発現系の検討を引き続き進めた。組換えタンパク質の細胞外分泌を発現プロトコールの改良や可溶化タグの付加を試みたが分泌効率の上昇には至らなかった。そこで、細胞内で蓄積凝集しているタンパク質の可溶化・精製・リフォールディングの検討を進めている。また、立体構造予測からタンパク質表面に露出すると思われる配列を参考に、ペプチド抗体の作成を進めた。作成した抗体を用いてタンパク質精製工程の確認や組織化学解析へ供試する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画していた組換えルシフェラーゼタンパク質の細胞外分泌を様々に試みているが、ポジティブな結果が得られていない。タンパク質の細胞外分泌を他の発現系で進めると同時に、不溶画分からのタンパク質精製を新たに検討する方向性の転換の必要が出てきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゴカイルシフェラーゼタンパク質の精製を進めると同時に、精製タンパク質を用いた酵素活性の解析を継続する。併せて、動物細胞以外のルシフェラーゼタンパク質の発現系を試み、大量合成にむけた検討を進める。また作成した抗体を用いた組織化学的解析を進める。
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| Causes of Carryover |
COVID-19のため参加予定していた国内・国際学会の延期・オンライン開催となり、旅費に計上していた予算を使用しなかった。
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