高効率な復帰変異株獲得に基づく膜蛋白質とリガンドの相互作用解明法の有用性の検証

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05750
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 篠原 康雄 徳島大学, 先端酵素学研究所, 教授 (60226157)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ADP/ATP輸送体 / ボンクレキン酸 / 復帰変異株 / タンパク質リガンド相互作用 / スラミン

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者はこれまでの研究で、ミトコンドリアのADP/ATP輸送体について、阻害剤の1つであるボンクレキン酸の存在下でもADP/ATP輸送活性を示す輸送機能復帰変異株を取得することで、ADP/ATP輸送体のボンクレキン酸と相互作用しているアミノ酸残基の同定が可能であることを明らかにしている。本研究ではこの方法の汎用性を確認する目的で、ADP/ATP輸送体の新たな阻害剤を探索し、その作用特性を解明したうえで、ADP/ATP輸送体とどのように相互作用しているのかを明らかにすることを計画した。
まず、アフリカトリパノソーマ症の治療薬として用いられているスラミンという化合物に焦点を当てた。この化合物のミトコンドリアのADP/ATP輸送体に対する作用について、2編の論文が発表されているが、いずれの解析も不十分なもので、①ミトコンドリアに添加した場合にADP/ATP輸送体をどの程度選択的に阻害するか、また②ミトコンドリア内膜の内外どちら側からADP/ATP輸送体を阻害するのかという2つの疑問が未解明のままであった。そこでこれらの疑問を解消する目的での実験を重ね、①スラミンをミトコンドリアに添加するとADP/ATP輸送体を阻害するが、ADP/ATP輸送体を完全に阻害する濃度では電子伝達系にも弱い阻害作用を示すこと、②スラミンはミトコンドリア内膜の外側からだけでなく、内側からもADP/ATP輸送体を阻害することを明らかにすることができた。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

もともとの実験計画では、研究協力者の九州大学先導物質化学研究所の新藤充教授が供与下さったボンクレキン酸誘導体を用いて、ADP/ATP輸送体の復帰変異株獲得を取得することで、ADP/ATP輸送体のボンクレキン酸と相互作用している様子を克明に明らかにする計画を立てていた。しかし、ボンクレキン酸誘導体の作用特性を明らかにするうえで、ミトコンドリアを用いた実験技術のスキルを高める必要性があることが判明したので、まずミトコンドリアのADP/ATP輸送体の阻害活性が報告されているsuraminに焦点をあて、その作用機構を解明する実験を通じて、ミトコンドリアでの実験技術のスキルの向上を図ることを進めた。
具体的にはミトコンドリアの反転膜小胞である亜ミトコンドリア粒子を調製し、ミトコンドリア内膜の内側からのADP/ATP輸送体に対する阻害活性の測定手技を確立することを進めた。この実験系を確立することによって、個々の阻害剤がミトコンドリア内膜の外側から輸送体に作用しているのか、あるいは内側からも作用するのかを解明することが可能になった。また、ミトコンドリアのADP/ATP輸送体の阻害剤として知られているカルボキシアトラクチロシドとボンクレキン酸はそれぞれ膜の外側と内側からADP/ATP輸送体を阻害することが知られており、今回の研究によってsuraminがADP/ATP輸送体を膜の両サイドから阻害する新しいタイプの阻害剤であることを明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

研究協力者の新藤充教授から提供いただいたボンクレキン酸誘導体のミトコンドリアへの作用についてはすでに解析し、結果を論文で発表している（Chem Biol Drug Design 86(2015)1304）。ボンクレキン酸やその誘導体をミトコンドリアに添加するとミトコンドリア膜を透過し、ミトコンドリアの内側からADP/ATP輸送体を阻害することが知られている。従って、ボンクレキン酸誘導体の活性は膜の透過性とADP/ATP輸送体への直接的な作用の両方によって影響を受ける。ADP/ATP輸送体への直接的な作用を調べるためにはミトコンドリアの反転膜小胞をである亜ミトコンドリア粒子を用いた実験系の構築が必要不可欠であった。昨年度の実験によってこの障壁をうまく乗り越えることができたため、今後はまずボンクレキン酸誘導体のADP/ATP輸送体に対する直接的な作用を解析していく予定である。

Causes of Carryover

実験に多くの消耗品を必要とするが、初年度は消耗品のストックを使用することで実験を遂行できたため、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した研究費と合わせて消耗品費に使用する予定である。