2021 Fiscal Year Research-status Report
Construction of bilin reductase library, promotes next-generation optogenetics.
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20K05758
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| Research Institution | Kurume National College of Technology |
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Principal Investigator |
萩原 義徳 久留米工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (10628548)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 光合成色素 / フィコビリン / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光は生物にとってエネルギー源や環境情報となり、色素を保持する光受容タンパク質がこれらの機能を担う。近年、動植物が有する光受容体を使って、神経刺激や遺伝子発現を光で制御する技術が見出され、オプトジェネティクス（光遺伝学）として注目が集まっている。しかし光駆動型タンパク質は、その種類によって吸収波長が異なり、任意の光を自在に用いることはできない。申請者らは、ヘム代謝産物からビリン色素を合成する酵素に着目し、その結晶構造を基に活性残基を改変することで、紫外から近赤外までの各光色を受容するビリン色素を生み出す酵素ライブラリを構築する。動物や植物、細菌が有するビリン色素をデザインし、光センサータンパク質と組み合わせることにより、任意の光色を複合的に用いたマルチタスク制御のオプトジェネティクスの促進を目指している。
フィコシアノビリンはクロロフィルが吸収できない橙－赤色光を吸収するビリン色素であり、ヘム代謝産物であるビリベルジンからビリン還元酵素PcyAによる還元を受けて合成される。先行研究におけるPcyAの高分解能結晶構造解析およびアミノ酸変異導入実験により、基質結合ポケットに位置する活性残基の一つ一つの機能が明らかとなりつつあるが、ビリベルジンを起点とする自由自在な色素デザインは未達成のままであった。
そこで本研究では、活性残基を順次あるいは複数個所を同時に変異し、その反応生成物の種類の同定や安定性の解析を行った。野生型酵素による生成物の立体異性体において、その量比や安定性には差があることが明らかとなり、生体内におけるその作り分けは光酸化等における何らかの生理学的な意義があると考察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PcyAの部位特異的変異体と基質ビリベルジンとの酵素反応を実施し、その紫外可視吸収スペクトルの経時変化を追跡した。また、酵素反応生成物のＨＰＬＣ分析により、生成物の同定を試み、かつ生成物量の時間変化も分析した。これにより、各反応生成物の安定性を評価した。本研究により、野生型酵素による生成物の立体異性体において、その量比や安定性には差があることが明らかとなり、生体内におけるその作り分けは光酸化を始めとする光合成関連の生理学的な意義があると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
単一あるいは多重部位特異的変異体の作製と、それらと基質ビリベルジンとの酵素生成物の吸収スペクトルやその分子量を測定し、新規ビリン色素のデザインを試みる。さらに、生成色素と光センサータンパク質との結合能も、大腸菌を用いた共発現系で評価を行う。
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| Causes of Carryover |
進捗状況に応じて、必要物品に若干の変更が伴ったため。次年度も予算を適切に使用する。
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