2020 Fiscal Year Research-status Report
網羅的な細胞内1分子イメージングによるGPCRome解析
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20K05760
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
柳川 正隆 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (70609792)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | GPCR / 1分子計測 / 1分子薬理学 / ハイコンテント解析 / 拡散機能相関 / 実験自動化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GPCRは薬の主要な標的分子である。本研究では、モデルGPCRにおける分子間相互作用計測と、網羅的なGPCRの1分子イメージングを行い、細胞膜中のGPCRの拡散動態を規定する分子基盤を明らかにすることを目的とする。これにより、任意のGPCRに対する複数の薬効を1分子イメージングで評価できる基盤を構築し、1細胞におけるGPCRの拡散動態変化から化合物評価を行うGPCRome解析を実現する。
2020年度は、S1PR1をモデルとしてシグナル伝達分子との相互作用を2色同時1分子イメージングにより解析し、拡散機能相関を明らかにした。また、様々なリガンド刺激前後のS1PR1分子の拡散動態変化を1分子タイムラプス計測により1細胞レベルで比較解析した。その結果、リガンド刺激後に生じる膜ドメインに集積し静止したS1PR1の増加が、アレスチン結合活性と強く相関することを見出した。また、リガンドのGiタンパク質活性は、S1PR1分子の自由拡散成分の低下割合と相関することが明らかになった。さらに、細胞膜上のS1PR1分子密度の変化は直接定量できるため、リガンドのエンドサイトーシス活性についても同時に評価できることが分かった。
以上により、化合物のGタンパク質・アレスチン・エンドサイトーシスの3経路の活性について、GPCR分子のみの動態変化から推定できることが分かった。本手法を用いることで、1細胞レベルでGPCRに対する化合物のシグナルバイアスを評価できるようになった。
また、本手法のスループットを向上し、他のGPCRに拡張するため、96ウェルプレート中での自動1分子イメージングができる顕微鏡システムを開発し、計測条件を探索した。機械学習を利用した細胞探索条件や、適正な発現量・蛍光標識条件の評価は概ね完了した。次年度以降は、本装置を用いて網羅的なGPCRの1分子計測を実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は、研究計画に基づきS1P受容体(S1PR1)をモデルとしたGPCRの拡散・機能相関の解析を中心に実施した。細胞膜中のS1PR1分子の拡散動態計測から、リガンドの3種の経路(Gタンパク質・アレスチン結合・エンドサイトーシス)に対する薬効を1細胞レベルで推定できることが明らかになった。現在は、本結果をまとめた論文を執筆中であり、当初の計画通り研究が進捗している。
また、網羅的な1分子計測によるGPCRome解析については細胞内1分子イメージングの自動化の条件検討の段階であるが、2020年度中に技術的な問題は概ね解決した。今後、1分子計測のスループット向上に伴い、研究の律速段階はデータ解析に移行すると考えられる。そこで、データ解析のワークフローに関しても高速化し、作成した解析プログラム(smDynamicsAnalyzer)をWEB上に公開した。また、本プログラムの使用法を含む細胞内1分子イメージングの計測・解析の詳細なワークフローについて、Invited Book Chapterに寄稿した。
さらに、上記の研究成果の一部を含む内容について、国内会議で3件の招待講演を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度は、アンジオテンシン受容体(AT1R)をモデルとしてGタンパク質やGRK・アレスチンとの2色同時1分子イメージングを行う。これによりGタンパク質活性化とアレスチン結合のバランスを調整するGRKによるGPCRのリン酸化を含めた、GPCRの細胞質側で生じる主な反応の素過程を抽出することができると考える。必要に応じて、他のGPCRでも一般性の検証を行う。
さらに、2020年度に確立した96ウェルプレートでの計測手法を用いて、約300種類のGPCRの1分子動態計測を開始する。また、1分子拡散動態変化に基づく薬効評価手法と既知の手法の比較を行うために、NanoBiTを用いたアレスチン結合アッセイを網羅的に行う。アレスチン結合アッセイはGタンパク質共役特異性によらず、比較的幅広いGPCRの薬効評価に用いられる手法であり、本研究の1分子動態計測がどの程度汎用的に使えるかの指標となる。
2022年度は、2021年度に引き続き網羅的なGPCRの拡散動態計測を行う。進化トレース法等を用いて、GPCRの拡散動態を規定する構造領域を推定する。推定が上手くいった場合、推定領域間をスワップしたキメラGPCRを用いて、拡散動態が想定通りに変化するかを比較する。
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| Remarks |
(1)(2) 1分子計測結果の解析マクロ: Yanagawa M and Sako Y, Methods in Mol. Biol. 2021, in press (Preprint version: BioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.08.141192)に使用法を解説
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Research Products
(9 results)
