2022 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集によるファイトケラチン合成酵素活性を強化したヒ素低集積イネの開発
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20K05778
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
石川 覚 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, グループ長 (40354005)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安部 匡 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, 上級研究員 (70729201)
倉俣 正人 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 農業環境研究部門, 主任研究員 (80826991)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ヒ素 / イネ / ファイトケラチン / カドミウム / ゲノム編集 / 食の安全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、イネのヒ素低減に向けて、ヒ素によるファイトケラチン合成酵素（OsPCS1）活性の仕組みを明らかに、アミノ酸配列の改変に伴うPCS活性の強化とゲノム編集を用いた低ヒ素イネの創製を目的としている。
昨年度までの結果、イネのファイトケラチン合成酵素であるOsPCS1のC末端側に、エラープローンPCRによって遺伝子改変し、酵母細胞を用いたAs耐性スクリーニングを行った結果、約240のヒ素耐性クローンを得た。本年度は獲得した耐性クローンの二次選抜を効率的に行う実験系を確立した。タンパク質生産用のベクター（pMAL-c5X）において、maltose-binding protein（MBP）の下流に蛍光タンパク質（GFP）を融合させ、さらにその下流に耐性クローンのOsPCS1を導入したプラスミドを大腸菌に組み込み、組換えタンパク質を生産させた。OsPCS1タンパクは大腸菌からの抽出後時間の経過に伴い活性の低下が認められたため、抽出したOsPCS1タンパク量をSDS-PAGEではなく蛍光プレートリーダーによるGFP蛍光強度で評価することとした。粗抽出タンパク溶液を還元型グルタチオンと亜ヒ酸溶液と反応させた後、生成したファイトケラチン量を蛍光強度によって補正することで簡便にOsPCS1の活性を評価する方法を構築した。
本方法で選抜された耐性クローンのOsPCS1精製タンパク質を用いて、研究初年目に確立したLC/MS/MSによるファイトケラチン合成量の測定を実施する。また、OsPCS1の活性が高まったアミノ酸配列情報をもとに、ゲノム編集を用いてPCS1機能強化型イネを作製することが今後の残された課題である。
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