2021 Fiscal Year Research-status Report
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20K05781
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
手塚 武揚 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (80646414)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 希少放線菌 / 休眠と覚醒 / 胞子嚢 / Clpプロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画は希少放線菌Actinoplanes missouriensisが形成する胞子嚢を材料として、細胞が栄養増殖状態から休眠耐久状態に移行する過程、および休眠細胞が外部環境の変化を感知して覚醒し、発芽に至る過程の分子機構の解明を目標としている。具体的な実験計画として、(1) 胞子嚢形成と胞子嚢開裂に必須であることが判明しているClpプロテアーゼ複合体のATPaseサブユニットをコードするclpXの転写制御機構の解析、(2) 胞子嚢形成と胞子嚢開裂の過程でClpXと複合体を形成するプロテアーゼサブユニットの同定、(3) 胞子嚢が開裂する過程でClpプロテアーゼ複合体によって分解されるタンパク質の道程とその機能解析、の3点に焦点を絞り、研究を進めている。
本年度は実験計画 (2) の条件検討を行った。A. missouriensisがコードする4つのプロテアーゼサブユニットClpP1, ClpP2, ClpP3, ClpP4それぞれを抗原とするポリクローナル抗体を既に得ており、またC末端にHisタグを付加したClpXを細胞内で生産する変異株を作製済みのため、抗Hisタグ抗体による共免疫沈降法とウエスタンブロットにより、ClpXと複合体を形成するプロテアーゼサブユニットの同定を試みた。種々の条件を検討したが、抗Hisタグ抗体を用いた免疫沈降サンプルにおいてClpP1, ClpP2, ClpP3, ClpP4のいずれも検出されなかった。これは細胞内でのClpXの生産量が少ないことが原因と予想される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験計画の (1) clpX遺伝子の転写解析についてはおおむね順調に進展しているが、(2) ClpXと複合体を形成するプロテアーゼサブユニットの同定、および (3) Clpプロテアーゼ複合体の基質タンパク質の同定については当初計画と比較して研究の進展が遅延しており、いずれも解決の目処がついていない。そのため、現在までの進捗状況はやや遅れていると評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Clpプロテアーゼ複合体の精製について条件検討を行い、ClpXと複合体を形成するプロテアーゼサブユニットの同定を引き続き進める。また、野生株とclpP3遺伝子破壊株の比較プロテオーム解析を行い、Clpプロテアーゼの基質タンパク質の同定を目指す。
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