ギ酸代謝関連遺伝子の探索とそれらを利用した高速ギ酸資化菌の創出

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05784
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 伊原 正喜 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (50391868)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: カーボンリサイクル / ギ酸資化菌

Outline of Annual Research Achievements

2020年度目標は、ギ酸資化菌の収集であった。ギ酸資化菌、特にセリン回路によりギ酸を効率よく同化できる株は、ほとんど探索されていない。申請者は、これまでに土壌サンプルをギ酸培地（大気下）に植菌し、ギ酸資化菌を探索した。しかし、いずれの単離株も、セリン回路によるギ酸同化ではなく、ギ酸を分解（異化）してカルビン回路経由で炭酸固定していることが明らかになった。ギ酸を炭素源且つ還元力源とした集積培養の際、ギ酸をギ酸ナトリウム塩として添加していたが、細胞に取り込まれるのは、ギ酸イオンとプロトンであるため、ギ酸資化が進むにつれて培地のpHが上昇していた。そのため、ギ酸資化菌の増殖後すぐに、プロトン濃度が低下するため、それ以上増殖できなかったと考えた。そこで、pH上昇に伴いギ酸を逐次添加する半回分培養（fed-batch）を試みた。そのために、pHが6.8を超えるとギ酸が添加される自動滴下装置を8台作製した。ギ酸自動滴下装置を用いて、代表的なセリン回路利用株（Methylorubrum extorquens）の半回分培養を検討したところ、最終到達バイオマス収量は数百倍に改善された。さらに、pH調節可能な平板培養として、ギ酸自動滴下装置を取り付けた液体培地に、孔径0.2マイクロメートルの膜を浮かべる方法を考案し、その膜上でコロニーとしてクローンを単離することに成功した。また、小スケール多検体培養として、ギ酸自動滴下装置を取り付けた液体培地に、透析チューブ（数ミリ容量）を入れて、その中にコロニーを植菌するという方法を考案した。スクリーニング実験として、新潟県汽水域サンプルを採取し、上記の通り集積培養および平板培養し、いくつかのクロ―ンを単離した。それらについて、セリン回路に特徴的なhydroxylpyruvate reductase活性を指標にセリン回路保有株の同定を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記の通り、ギ酸資化菌スクリーニングに必要な培養方法の開発に成功しており、候補株の単離にも成功しているため、おおむね順調に進展している。まだ、候補株は少ないが、後述の通り、スクリーニング方法をさらに改良しており、今後より多くの候補株を単離できると考えている。

Strategy for Future Research Activity

現在進めているギ酸資化菌スクリーニング方法の改良策は、まず、集積培養の際に“集積しすぎない”ことである。その代わりに、続く平板培養では多くのコロニーを取得する必要がある。しかし、膜を液体培地に浮かべた平板培地ではコロニー形成率が低い傾向があったため（原因解明中）、メタノールをギ酸の代わりに添加した寒天もしくはゲランガム平板培地も併用する。メタノールを用いる理由は、代謝されても培地のpH変化が小さいためであり、多くのギ酸資化菌はメタノールをギ酸に分解して資化することができるためである。なお、メタノールをギ酸に分解できないギ酸資化菌は単離できないが、今回はそのような株は扱わない。現在は、多様な自然サンプル（淡水や汽水、海水、汚泥、土壌、植物表面、アリ塚）からの探索実験を本格化しており、ギ酸資化菌候補を多数分離しつつある。

Causes of Carryover

軽微な次年度使用額が生じたが、翌年度消耗品の購入で執行予定である。