2021 Fiscal Year Research-status Report
A novel platform of functional nanostructure-a unique outer-synthesis of unique membrane vesicles and their application-
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20K05786
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
川本 純 京都大学, 化学研究所, 准教授 (90511238)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 外膜小胞 / タンパク質輸送 / 表層多糖 / 莢膜多糖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞外膜小胞（Extracellular membrane vesicles, EMVs）生産性に秀でた細菌 Shewanella vesiculosa HM13 を対象に、本菌より見いだされた選択的な積荷タンパク質輸送機構の解明と、その応用を主目的としている。本菌の EMVs には単一の積荷タンパク質 SvP49 が輸送されるが、本タンパク質の選択的な輸送には本タンパク質遺伝子の近傍に存在する糖鎖関連タンパク質の関与が示唆されていた。そこで、これらの遺伝子群によって合成される糖鎖と積荷タンパク質との相互作用を解析するため、積荷タンパク質と EMVs との相互作用を in vitro で解析した。精製した積荷タンパク質と、積荷タンパク質遺伝子破壊株より回収した EMVs を混合した結果、積荷タンパク質とEMVs は共沈降した。一方で、糖鎖合成に関与するフリッパーゼホモログ遺伝子 wzx の欠損株の EMVs とは共沈降しなかった。wzx 遺伝子を相補した株から調製した EMVs と積荷タンパク質は共沈降したことから、wzx 依存的な経路で合成される糖鎖と積荷タンパク質の相互作用が示唆された。先行研究において、本菌の表層多糖は O 抗原をもたないリポ多糖（リポオリゴ糖）であることがわかっている。グラム陰性細菌における Wzx は、リポ多糖や莢膜多糖の合成に関与することが報告されていることから、本菌においては、Wzx が関与する生合成経路で合成される莢膜多糖との相互作用によって、EMV に導入される可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、細胞外膜小胞（EMVs）高生産性細菌 Shewanella vesiculosa HM13 の EMVs への選択的なタンパク質輸送は、フリッパーゼホモログ Wzx 依存的に合成される莢膜多糖と積荷タンパク質との相互作用により進行することが示唆された。本機構を応用した EMV輸送を介した異種タンパク質生産や、EMVsの表層改変には、積荷タンパク質と EMVs の莢膜多糖との相互作用機構の理解が必要となる。一方で、本菌の EMVs 表層に存在する莢膜多糖の構造や積荷タンパク質との相互作用の分子機構の詳細は依然と明らかにできておらず。計画以上の進展とは言いがたい。よって、2) 「おおむね順調に進展している。」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の研究結果から、S. vesiculosa HM13 における細胞外膜小胞 (EMVs) への積荷タンパク質の輸送には、タンパク質と莢膜多糖との相互作用の存在が示された。一方で、本菌 EMVs の莢膜多糖の詳細な構造や、タンパク質との相互作用に関与するタンパク質領域や糖鎖のモチーフは明らかでない。今後は、EMVs の莢膜多糖と積荷タンパク質の相互作用機構を、より詳細に解明することを目的に、カロリメーターを用いた分子間相互作用解析、積荷タンパク質および糖鎖生合成関連タンパク質への変異導入による相互作用への影響の解析、莢膜多糖の構造解析を行う。一方で、莢膜多糖と積荷タンパク質との相互作用による選択的なタンパク質輸送機構を応用した異種タンパク質の分泌生産や、EMVs の表層改変によるナノ触媒材料の開発を目的、積荷タンパク質への異種タンパク質およびペプチドタグ配列を挿入し、積荷タンパク質の EMV 局在性への影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
2021年度に、本研究で対象とする細菌 Shewanella vesiculosa HM13 の細胞外膜小胞の表層多糖を解析した結果、主要な多糖として O 抗原をもたないリポオリゴ糖に加え、高分子の糖成分が存在することがわかった。この高分子多糖は、本菌のゲノムより見いだされた O 抗原フリッパーゼのホモログ遺伝子 wax の破壊により消失したことから、莢膜多糖と予想された。本菌における莢膜多糖の存在はあきらかにされておらず、その構造や細胞表層の可視化実験を追加する必要が生じたため、未使用額が生じた。このため、莢膜多糖の精製と詳細な構造情報の取得、および電子顕微鏡による細胞表層の可視化を次年度に行うこととし、未使用額はその経費に充てることとする。
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