2022 Fiscal Year Annual Research Report
高等真菌類によるエネルギー消費削減型糖代謝機構解明のための分子基盤構築
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20K05794
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
知久 和寛 日本獣医生命科学大学, 応用生命科学部, 准教授 (30711618)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 高等真菌 / キノコ / 酵素 / 糖 / キノコゲノム / ゲノム解析 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キノコは、デンプン、セルロース、キチンなどの代表的な植物性・動物性多糖の分解を得意とし、それらの資化に関わる多様な酵素群を持っている。本研究では、これら酵素群を介したキノコの特異な糖代謝機構を解析するため、その分子基盤として、キノコによる宿主・ベクター系の構築を行った。さらにキノコが保有する糖関連酵素遺伝子ライブラリーを構築するとともに、それら遺伝子を発現し、機能評価を行った。
キノコの保有する糖関連酵素遺伝子ライブラリーの構築のため、糖質代謝に秀でたキノコ菌種７株のゲノム解読を行った。その後、バイオインフォマティクス手法により、ゲノム中から遺伝子を予測し、BLAST検索により各遺伝子の機能推定を行った。予想された遺伝子からは多数の糖関連酵素遺伝子を見出すことができ、菌ごとの特徴について調べることができた。
一方、キノコが保有する恒常性遺伝子を対象にそのプロモーター領域とターミネーター領域を組み込んだ遺伝子発現ベクター①を構築後、ポリエチレングリコールを用いた形質転換法によりキノコを形質転換した。組み込んだプラスミドにより、形質転換したキノコはハイグロマイシンに対する薬剤耐性を発現した。しかしながら同時に発現系の構築を行った組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子の発現量は、蛍光分光法などで観察を試みたものの微弱であった。そこでトランスクリプトーム解析により発現量が多かった糖関連酵素遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域を用いた、別の遺伝子発現ベクター②の再構築を行った。遺伝子発現ベクター①に比べて、遺伝子発現ベクター②を用いた形質転換体の方がGFP由来と思われる高い蛍光強度を示したが、SDS－PAGEでは発現した組換えGPFタンパク質と考えられるバンドは得られなかった。遺伝子発現ベクターが正常に機能していない可能性を考え、内部塩基配列の組換えなどの検討をした。
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