2020 Fiscal Year Research-status Report
カナマイシン生産放線菌の遺伝子増幅機構を利用した分子育種法（ZouA法）の確立
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20K05799
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| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
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Principal Investigator |
石崎 仁將 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 主任研究員 (10414103)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ZouA法 / caprazamycin高生産 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，放線菌 Streptomyces kanamyceticus に見出された DNA 配列増幅機構を他種，他属の細菌株の二次代謝産物生合成遺伝子クラスターに適用すること（ZouA法）により，遺伝子クラスターの増幅と代謝産物の生産量増加を達成することを目的としている。
令和2年度においては，放線菌 Streptomyces sp. MK730-62F2 株の caprazamycin 生合成遺伝子クラスターの増幅を試みた。遺伝子クラスター中の大部分の塩基配列はすでに知られているため，その両末端にZouA法適用に必要な配列を導入した。具体的にはクラスターの上流側に DNA reluxase-like protein 遺伝子 zouA と相同配列の一方であるRsA，下流側にもう一方の相同配列 RsB と apramycin 耐性遺伝子を導入している。得られた株を sub-MIC 濃度の apramycin 存在下で 5 回継代した結果，1 株において遺伝子クラスターの増幅と caprazamycin（前駆体）の生産量増加を確認した。
また，前駆体でなく caprazamycin そのものを高生産するためには，生合成遺伝子クラスターの全長とその上下流数 kbp の配列が必要になるため，ゲノムシークエンスによってその配列を決定した。
また，Streptomyces属と遠縁の菌種においても ZouA 法の適用が可能かを検討するため，大腸菌を用いたZouA 活性検出系の構築も進めている。pET ベクターを用いて ZouA タンパク質の発現を試みると共に，RsA，RsBを有し，GFPをレポーターとするプラスミドの作製も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Stremtomyces 属細菌由来の ZouA システムは，期待通り同属のcaprazamycin生産株に適用可能である事が分かった。ただし，現行の方法では選抜に高濃度の apramycin を要する事，遺伝子増幅（すなわち apramycin 耐性遺伝子の多コピー化）を伴わない薬剤耐性株が得られる事，遺伝子増幅株においても継代培養中にコピー数が低下するなど，技術的にはいくつかの改善すべき点が残っている。
大腸菌における ZouA 法の検出においては，ZouA タンパク質の高発現が達成されていない。in vitro 解析を視野にタグ付きのタンパク質の発現を試みている事，zouA が高 GC 含量の遺伝子である事などが原因と考えられるため，まずはタグのない野生型 ZouA タンパク質を発現させる，発現用の大腸菌株を変える等の対応を考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は概ね順調に進展しているため，引き続き交付申請書に記載の実験実施計画に沿って進める。具体的には，caprazamycin 生合成遺伝子クラスター全長の増幅および，大腸菌における系の構築を進めていく予定である。
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