2020 Fiscal Year Research-status Report
Molecular breeding of a novel streptomycete host for antibiotic production using genomic information to highly establish lignocellulose as a resource
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20K05810
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
春日 和 秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (40315594)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リグノセルロース / セルラーゼ / キシラナーゼ / Streptomyces属放線菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は、リグノセルロース(LC)資化放線菌Y2944におけるLC資化能の成立ちの仕組を明らかにし、LCを原料とした新たな物質生産系の構築に活用するものである。R2年度は以下の成果を収めた。
1）LC資化遺伝子の発現解析：LC系基質の資化に必要な遺伝子を解明するため、Y2944のセルロース及びキシランでの培養時に転写レベルで高発現する遺伝子をRT-PCR及びRT-qPCRにより調べた。(1)結晶セルロース(Avi)及びセロビオース(Ceb)での培養において、10のセルラーゼ遺伝子のほとんどがグルコース培養に比べて顕著に発現誘導された。うち9遺伝子は上流域にCebR boxが存在し、CebR制御系が機能していると示唆された。(2)2つのcebRは構成的に発現し、CebRの制御下にあると推定されたcebE1はAvi及びCebの培養で発現が顕著に誘導された。(3)グルクロノキシラン(GXn)及びグルクロノアラビノキシラン(GAXn)での培養において、7つのキシラン主鎖分解酵素遺伝子の顕著な発現を明らかにした。(4)キシラン側鎖切断酵素遺伝子のうち、1グルクロニダーゼ遺伝子と2 アセチラーゼ遺伝子がGXnとGAXnの培養で、5のα-アラビノフラノシダーゼ遺伝子と1 フェルラ酸エステラーゼ遺伝子がGAXn培養で発現した。以上より、ゲノムから見出された数多くの資化関連遺伝子群からセルロース・キシランの資化時に発現する遺伝子を明らかにした。
2）C42の育種改良に有効な遺伝子の選抜：Y2944の10のセルラーゼ遺伝子全てについて強制発現プラスミドを構築し、セルロース資化放線菌宿主C42に導入した。遺伝子導入株について可溶性セルロースCMCで培養し、C42の総セルラーゼ活性を向上させる2遺伝子を明らかにした。今後Avi培養における遺伝子導入の効果についても検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
基礎研究はおおむね予定通り進行している。
1)「LC資化遺伝子の発現解析」では、予定していた遺伝子の大半の解析が終了している。
2)「C42の育種に有効な遺伝子の選抜」では、セルロース資化に関する遺伝子の選抜は実験計画の半ばまで進行しており、あと半年で目処がつく。キシラン資化に関する遺伝子の選抜は、現在、各遺伝子の発現ベクターを構築しており、R3年度内の終了を目指している。
3)「遺伝子産物の機能解析」は、2)の結果に基づきプラスミドが構築できたものから順に実験を開始する予定である。
R2年度には着手できなかった応用研究に関しては、R2年度の成果に基づいて今年度着手する。
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| Strategy for Future Research Activity |
R2年度は放線菌Y2944がセルロース・キシランを資化する際に発現するセルロース・キシラン資化関連遺伝子群をRT-qPCRのレベルで明らかにした。当初の予定ではこの後に、顕著な発現が認められた遺伝子の強制発現と遺伝子産物の機能解析を行う予定であった。
しかし、Y2944において顕著に発現した資化関連酵素遺伝子の種類、数は多かったが、実際にこれらの遺伝子産物が菌体外に分泌されているかは不明である。そこで、上記の機能解析を行う前に、Y2944がセルロース・キシラン資化時に分泌する主要タンパク質を明らかにするため、セクレトーム解析の実施も検討している。まずは、培養上清の濃縮やタンパク質の電気泳動の条件を検討し始めている。
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| Causes of Carryover |
R2年度は当初予定していた旅費での支出が全くなかった。
RT-qPCR関連の消耗品での支出が多かったものの、すべてを使用するまでには至らなかった。
R3年度は旅費に関しては不透明であるが、タンパク質分析関連など研究に必要な物品の購入費などにあて、今後も適切な経費執行を心がける。
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