2023 Fiscal Year Research-status Report

Molecular breeding of a novel streptomycete host for antibiotic production using genomic information to highly establish lignocellulose as a resource

Research Project

Project/Area Number	20K05810
Research Institution	Akita Prefectural University
Principal Investigator	春日和秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (40315594)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2025-03-31
Keywords	リグノセルロース / キシラナーゼ / Streptomyces属放線菌
Outline of Annual Research Achievements	R5年度は、セルロース資化性の有用物質生産放線菌宿主Streptomyces thermocarboxydus C42株に，リグノセルロース高度資化放線菌Streptomyces galbus Y2944のキシラナーゼ遺伝子を導入して，C42宿主のキシラン資化能および有用物質生産能を向上させる遺伝子を特定することを目的とした。今年度は，C42，及びC42にカスガマイシン(KSM)異種生産能を付与した組換株C42/pKSM109に，Y2944由来キシラナーゼ遺伝子を導入して，キシラン分解能およびKSM生産能への遺伝子導入効果を調べた。(i) まず，C42/pKSM109へのキシラナーゼ遺伝子導入を可能にするためのキシラナーゼ遺伝子(xyn10A, xyn11A, xyn11B)発現ベクター(pKU492Aシリーズ)を構築した。(ii) これらプラスミドベクターをC42に導入して，3種のキシラナーゼ遺伝子が発現し，組換え株の培養上清においてキシラン分解活性が向上することを確認した。(iii) これらの発現プラスミドをC42/pKSM109に個々に導入してキシラナーゼ活性およびKSM生産能の向上を評価したが，これらの組換え株において培養上清中のキシラナーゼ活性やKSM生産量は向上しなかった。以上の結果より，KSM生産遺伝子群を強く強制発現させたKSM異種生産菌においては、さらにキシラナーゼ遺伝子を単独で導入してもキシランの資化能およびKSM異種生産能の向上に直接寄与しないと結論づけられた。そのため，これらの能力を向上させるためには、複雑な構造を有するキシランの分解能を向上させ，さらに分解産物の取込みやその後の糖代謝を含めてキシランの資化能を全体的に向上させる必要があると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 本年度の研究成果より、C42のキシラン資化能をY2944由来の外来遺伝子の導入により向上させて異種生産宿主として利用するためには、キシラナーゼ遺伝子を単独で導入させても実現しないことが明確に示された。これは、Y2944遺伝子の単独導入によりC42のセルロース資化能を向上させる試みが成功しなかった(R4年度成果)ことと同様であると結論づけた。そのため、C42のリグノセルロース(セルロースおよびキシラン)資化能を外来遺伝子導入により向上させるためには、C42が保有せずY2944が保有する分解酵素および資化関連遺伝子等を複数組み合わせて導入する必要がある。これまでにセルロースおよびキシラン資化に関連する既知遺伝子については遺伝子発現量を調べ、Y2944の優れた資化能に寄与すると推定される遺伝子を明らかにしている(R2-3年度)。以上の結果に基づいて複数遺伝子を選定して同時に導入する試みを行うべきと考えている。また一方で、培養上清のタンパク質解析(MS/MS分析)により遺伝子レベルで未解析のタンパク質が新たに検出されている(R3年度)。このタンパク質解析はまだ精度を高めた実験が必要な状況であり、Y2944のキシラン資化能を担う因子を特定するため、再度培養条件を検討した上で分析を行いたい。
Strategy for Future Research Activity	今年度の研究方針は、以下の2点である。 (1) 資化向上プラスミドの構築と導入効果の検証：C42宿主に導入すべきセルロース及びキシランの資化関連遺伝子群をそれぞれ選定し、PCR増幅したDNA断片を染色体組込型ベクターに連結して、セルロース資化向上プラスミド、及びキシラン資化向上プラスミドを構築する。これらをC42宿主及びC42/pKSM109に導入し、セルロースまたはキシランの資化能やKSMの異種生産能が向上するか検討し、C42宿主を用いたリグノセルロースからの物質生産宿主の改良のポテンシャルについて検討する。 (2) Y2944によるキシラン資化を担うタンパク質因子の解析：キシラン類を主要炭素限としたY2944の培養条件(時間と培地組成など)、及びタンパク質分析方法を再検討し、タンパク質分解の影響が少ないタンパク質試料を調製して、Y2944のセクレトームにおける主要タンパク質を明らかにする。これによりこれまで知見の少ない放線菌におけるキシラン分解の仕組みの解明を推進する。
Causes of Carryover	R5年度において、研究を推進するための時間と人手が不足する予想外の事態に陥り、研究計画の一部を次年度に延長申請せざるを得なくなった。そのため、R6年度に計画を延期することとし、その実験に必要な経費（消耗品購入費や外部への分析依頼経費など）をあえて残しておく必要があった。