2022 Fiscal Year Research-status Report
Creation of novel amino acid metabolizing enzymes by genome information and protein engineering
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20K05816
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| Research Institution | Osaka Institute of Technology |
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Principal Investigator |
大島 敏久 大阪工業大学, 工学部, 教授 (10093345)
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2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 耐熱性酵素 / 人工酵素 / アミノ酸脱水素酵素 / ゲノム情報 / 酸化還元酵素 / 酵素リアクター / 機能改変 / アミノ酸代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和３年度までにゲノム情報をもとに見出したPseudomonas veronii の新規NADP依存性L-アルギニン脱水素酵素（L-ArgDH）遺伝子の大腸菌での発現と発現産物の安定化に成功し、L-ArgDHとしての酵素化学的特徴の解明とL-Argの酵素分析への応用開発を行った。令和４年度は、それらの成果を研究会で口頭発表するとともに学術誌Proteins Expr. Purif.へ論文として、また日本ビタミン学会和文誌に論文紹介を行った。一方、ゲノム情報から好熱性胞子形成菌Geobacillus kaustphilusに２種類のアラニン脱水素酵素（AlaDH）の遺伝子ホモログ（GK2752とGK3448遺伝子）を見出した。両遺伝子の大腸菌での発現に成功し、両発現産物が強いAlaDH活性を持つことを確認し、それぞれを組換え大腸菌から均一に精製し、酵素化学的特徴の解明、立体構造の解明した。また、両酵素活性の生理的機能を解明するために、栄養（増殖）と胞子（耐久）細胞における酵素の発現様式を解析した。その結果、栄養型細胞から精製したAlaDHはGK3448-AlaDHに、一方胞子から精製したAlaDHはGK2752-AlaDHとそれぞれのN-末酸のアミノ酸配列(数残基）が一致することが明らかになった。この成果は、2つの異なるAlaDHがそれぞれ、異なる細胞増殖ステージで生産されていることを最初に示したもので、AlaDHの生理的機能の解明への今後の展開が期待できる。この成果は学術誌Biochim. Biophys. Acta.に投稿し掲載された。さらに、ゲノム情報に基づいたアミノ酸脱水素酵素の検索を行い、好熱菌のL-トリプトファン脱水素酵素ホモログ遺伝子と超好熱アーキアのロイシン脱水素酵素遺伝子の大腸菌での発現に成功した。両者酵素の精製と特徴の解析と機能改変を現在進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成４年度は新規L-アルギニン脱水素酵素の機能解明と酵素分析法の開発への応用研究に関する成果をまとめ、学術雑誌への投稿論文執筆に専念したが、査読とそのコメントに対するデータの修正のため、必要とした再実験などに予想以上の時間を要したことと、またゲノム情報から見出した好熱菌Bacillus kaustophilusにの２種のアラニン脱水素酵素遺伝子を見出し、両者に関する機能解析と構造解析の研究成果を学術論文にまとめ、投稿するためのデータの準備に予想以上に時間を要した。このことが、当初の計画に比較して実験研究の遅れとなった。また、令和４年度の研究の成果として、ゲノム情報をもとに有用酵素遺伝子を見出し、その遺伝子を人工合成後、大腸菌で発現後、その遺伝子発現産物の機能解析を行う研究を推進したが、酵素の発現は達成できた。しかし予想に反し、安定性が極めて低いことや予期しない酵素の沈殿形成が発生したために、その解決法を種々検討するのにかなりの時間を要した。また、前年度につづき新型コロナ禍の影響もあり、本研究者も罹患したこともあり、少なからず実験研究とその結果の分析などの時間に制限が出てきたことも、研究の進展の遅れにつながったと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和３年度に酵素科学的特徴と応用に関する研究成果を論文として発表したL-ArgDHに関しては、他大学の研究協力者による構造解析が完了したので、その結果を論文として学術誌へ投稿中である。また、ゲノム情報解析から90℃で生育できる超好熱アーキアに初めてValDHを見出し、その遺伝子の大腸菌での発現に成功した。しかし、予想に反して、発現産物が通常のリン酸緩衝液中では重合して不活性な沈殿を形成し、その沈殿は高濃度の尿素の添加により可溶化され、高い活性を示す珍しい特徴を持つことを見出した。この可溶化した新規酵素の特異的な精製法の確立、酵素科学的特徴、立体構造などを解明する。
次に、ゲノム情報から85℃で生育する超好熱細菌にmeso-Diaminopimelate dehydrogenase（DAPDH）のホモログ遺伝子を見出したので、この遺伝子の大腸菌での発現と発現産物（酵素）の精製と酵素化学的特徴、立体構造の解明後、そのDAPDH遺伝子の人工的な改変を設計して、最も安定性に優れた人工D-amino acid dehydrogenase を創製する。その特徴を解析し、耐熱性D-アミノ酸合成用人工酵素の開発を進める。そのほかに、臨床分析用酵素として有用性が期待できる高い安定性を示すTrpDHについても、同様ゲノム情報に基づき機能開発を進め、アミノ酸代謝関連酵素の新しい機能創製法を開拓する。
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| Causes of Carryover |
当初は、それまでに得られた研究成果の国際学会やシンポジウムでの発表のための国内外出張旅費の経費を計上していたが、新型コロナウイルス禍により、不可能になった。また国内での学会も同様新型コロナウイルス禍により、福岡大学（福岡市）での日本ビタミン学会などの一部を除き、対面式の学会や研究集会発表は中止やオンライン方式に変更になったために、参加のために必要な旅費などの経費が大幅に減少した。年度末には新型コロナウイルスの影響も減少の傾向が出てきたので、次年度には、国内外の研究集会の参加や研究打合わせ会議などへの積極的な参加を計画している。また、前年度までに得られた実験的データを学術論文として投稿し、査読結果を踏まえた再実験などを行い、データや論文原稿の修正のために、当初の予想より、長時間を要した。そのために、計画どおりゲノム情報から得ていたアミノ酸代謝に関連する新規酵素の機能解析、機能改変のデザイン、人工酵素の創製と構造に関する実験研究を予定通り効率的に実施できなくなったために、当初予定していた試薬の購入や人工酵素遺伝子の外部発注、機能や構造のデータ分析に必要とする人件費などが減額や不要となり、次年度に繰り越しするに至った。そのために次年度使用額が生じた。
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