機能性乳酸菌を作出するための新規ゲノム改変技術の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05818
• Research Institution: Fukuoka University
• Principal Investigator: 鹿志毛 信広 福岡大学, 薬学部, 教授 (80185751)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 朝光 福岡大学, 薬学部, 准教授 (90369025) ; 山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 乳酸菌 / ゲノム組み込み型ベクター / 遺伝子改変

Outline of Annual Research Achievements

本研究では選択圧の無い環境下においても遺伝的形質を安定に保持し、なおかつ危険な薬剤耐性菌を生じる可能性のある薬剤耐性遺伝子に依存しない安定かつ安全な乳酸菌の遺伝子改変技術を確立することを目的として、ゲノム組み込み型宿主―ベクターの開発と組換えによってゲノムに配座した薬剤耐性遺伝子を除去することが出来る in vivo excision システムの構築を行なう。
申請時においてヒト糞便中から単離された Lactobacillus casei ATCC27092(以下 L.casei:全ゲノムシーケンス同定済)に溶原化する PL-2 ファージ integrase 遺伝子とアタッチメント サイト(attP)からなる部位特異的組換え領域を用いて大腸菌ではプラスミド型、乳酸菌ではゲノム組み込み型として機能するシャトルベクターpAE0を構築し、その宿主として PL-2 ファージ溶原株である L.casei から PL-2 ファージを脱落させたキュアリング株 (C5株)を単離している。pAE0 にEPA 合成遺伝子を挿入してC5株を形質転換したところ、得られたC5EPA株は選択圧のない条件下 70 世代の培養後においても EPA 合成遺伝子を保持しており、液体クロマトグラフによりEPAの産生が確認されている(未発表データ)。
本年度はゲノム組み込み型で乳酸菌ゲノムに外来遺伝子と同時に配座するベクター由来の大腸菌の複製ユニット(Ori)とエリスロマイシン耐性遺伝子(EmR)を含めた不要領域（Ori-EmR）を除くin vivo excisionシステムを構築するために以下の実験を行った。
1）D-リボース誘導性に致死性遺伝子を発現するカウンターマーカーベクターの作製
2）NaCl誘導性に組み換え酵素FLPを発現するin vivo excision ヘルパープラスミドの作製

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1. 乳酸菌ゲノムに外来遺伝子を導入するベクターに含まれるOri-EmRがin vivo excisionシステムによって除かれたクローンの選択をするためにOri-EmRが切り出されなかったクローンを誘導的に死滅させるウンターマーカー(致死性遺伝子)を作製した。リボースで発現が亢進するL.caseiに由来するGlcNacaseのプロモーター領域とL.caseiの溶菌性ファージPL1のHolynおよびLysinの溶菌酵素遺伝子を連結することでリボース誘導性の致死性遺伝子(Glys)を作製した。
2. in vivo excisionシステムの構築は酵母に由来する組換え領域(FRT)と組換え酵素(FLP)を利用し、ゲノム組み込み型ベクターでFRTの内側にOriとEmRとGlysを、外側にIntegraseを挿入する形でゲノム組み込み型ベクターpGlcHLys(ATG)を作製した。pGlcHLys(ATG)によって形質転換された乳酸菌ATG211株はグルコース培地では生育するが、リボース培地では溶菌酵素により増殖が抑制されることを期待した。現在、pGlcHLys(ATG)をゲノム上に保持するATG211株の培養上清、菌体内抽出物を用いた溶菌試験では、リボース含有培地で培養した場合にわずかな溶菌活性と寒天培地における増殖抑制を確認した。
3. 乳酸菌ゲノム上に配座するOri-EmRを組み換え反応によって削除するために誘導的に組み換え酵素を発現するヘルパープラスミドを構築した。NaCl感受性に発現が亢進するOpAA遺伝子のプロモーター下流にFLP遺伝子を連結し、乳酸菌内で複製可能なプラスミドpHILcFLPを作製した。ATG211株にpHILcFLP導入した株(211cFLP株)について300mMNaClの添加によってFLPの発現が確認された。

Strategy for Future Research Activity

211cFLP株を用いて外来遺伝子が乳酸菌ゲノムに配座した後にNaCl誘導性にFLPが発現し、その基質であるゲノム上のFRT配列によって組み替えが起こり、その領域に挟まれるOri-EmRが除去されるかどうかを検討する。
またATG211株の溶菌活性は寒天プレート培地にでの増殖抑制は確認できているが、液体培地条件下の増殖抑制は軽微であるため、溶菌活性を上昇させる条件検討を行う必要がある。
一方、C5EPA株のゲノム解析と産生されたEPAの質量分析を行い、菌体あたりのEPA活性を定性定量的に解析を行う。
また、疫病カビ（Saprolegnia diclina）由来EPAの産生にはC18:1のアラキドン酸からC20:5ののEPAと変換されること、その過程でデルタ17-Desaturaseの活性が律速段階であることが報告されている。我々が作製したC5EPA株によるEPAの産生は野生型L.CaseiのC18:1に対してピークが減少していることから、C5EPA株においてもEPAの産生にC18:1が利用されている可能性がある。
このことからL.Caseiへの17-Desaturaseの cDNAの導入と発現系を構築し、EPA産生の効率化が上昇するかどうかを検討していく。

Causes of Carryover

コロナ禍で出張等が制限され、研究打合せ等の旅費の執行が出来なかった。また、プラスチック製品（チップ、PCRtチューブ）の国内在庫が少なく、当該年度内の納品が完了しなかった消耗品もあったので、今年度の余剰金部分については、次年度に該当消耗品の購入に使用する計画である。