機能性乳酸菌を作出するための新規ゲノム改変技術の確立

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K05818
• Research Institution: Fukuoka University
• Principal Investigator: 鹿志毛 信広 福岡大学, 薬学部, 教授 (80185751)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 朝光 福岡大学, 薬学部, 教授 (90369025) ; 山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 乳酸菌の遺伝子改変技術 / ゲノム組み込み型宿主―ベクター / in vivo excision システム

Outline of Annual Research Achievements

本研究では選択圧の無い環境下においても遺伝的形質を安定に保持し、薬剤耐性菌を生じる可能性のある薬剤耐性遺伝子に依存しない安定かつ安全な乳酸菌の遺伝子改変技術を確立することを目的として、ゲノム組み込み型宿主-ベクターの開発と組換えによってゲノムに配座した薬剤耐性遺伝子を除去することが出来るin vivo excisionシステムの構築を行なった。申請時においてヒトから単離された Lactobacillus casei ATCC27092(以下 L.casei:全ゲノムシーケンス同定済)に溶原化する PL-2ファージintegrase遺伝子とアタッチメントサイト(attP)からなる部位特異的組換え領域を用いて大腸菌ではプラスミド型、乳酸菌ではゲノム組み込み型として機能するシャトルベクターpAE0を構築し、その宿主としてPL-2 ファージ溶原株であるL.casei からPL-2ファージを脱落させたキュアリング株 (C5株)を単離している。pAE0にEPA合成遺伝子を挿入してC5株を形質転換したところ、得られたC5EPA株は選択圧のない条件下 70 世代の培養後においても EPA合成遺伝子を保持しており、HPLCによりEPAの産生も確認した(未発表)。前年度までにゲノム組み込み型で乳酸菌ゲノムに外来遺伝子と同時に配座するD-リボース誘導性に溶菌酵素を発現するゲノム組み込み型のカウンターマーカー（GLys）を除くin vivo excisionシステムの構築に成功していることから、さらに本年度は以下の実験を行った。
1）組み換え乳酸菌ゲノム上FRT間の長鎖高分子遺伝子の組み換え除去
2）Cytosine deaminaseを用いたカウンターマーカーの作製
3）EPA合成酵素17-DesaturaseやIL-1β阻害ペプチドをコードする遺伝子のL.caseiゲノム組み換え体の作製