2020 Fiscal Year Research-status Report
Study of bio-degradable plastics decomposition mechanisms in deep sea environment using recombinant enzymes
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20K05819
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| Research Institution | Ichinoseki National College of Technology |
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Principal Investigator |
中川 裕子 一関工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (70435577)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 真巳 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80223006)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 組換え酵素 / ブレビバチルス / ウエスタンブロット / PCL / エステラーゼ / 生分解性プラスチック |
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| Outline of Annual Research Achievements |
組換えエステラーゼを得るため、ブレビバチルスの発現系を用いて候補遺伝子2つの発現を試みた。先に2種類のベクターにクローニングが済んでいた遺伝子に関して、ベクターのうちのひとつでHis抗体を使用したWestern blotによる発現を確認した。ニッケルカラムを用いた精製を試みたが、うまく精製ができなかった。また、組換えタンパクの発現量も少なかった。もう一つの候補遺伝子に関しては、スモールスケールでの発現確認を行っているところである。この系では両者とも発現量が少ないことを想定し、微生物のタンパク質生産量を向上させる手立として、生産されるタンパク質の先頭11個のアミノ酸配列が同一のまま、コドンを最適化した遺伝子を使って組換えエステラーゼを生産させる方法に着手したところである。
並行して、PCLを処理したJT01自体からの酵素精製も試みた。硫安塩析では、比較的強いエステラーゼ活性を示す画分が得られたが、まだどの大きさのタンパクがエステラーゼ活性を持つのかの特定には至っていない。また、比重の重いプラスチック分解能を評価する方法を用いて、PETの分解能を調査したが、JT01はPET分解能を持たないことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
大腸菌ではうまく行っていなかった組換えエステラーゼの発現に、ブレビバチルスの発現系を用いることで、発現量が向上することを期待していたが、十分な量の発現が得られなかった。また、ポジティブコントロールに使用するエステラーゼ1種 (H39)の精製が済んでいない。
JT01自体からの酵素精製では、比較的強いエステラーゼ活性を示す画分が得られたが、それほど明確なバンドは得られず、まだどの大きさのタンパクがエステラーゼ活性を持つのかの特定には至っていない。JT01は低温でも活性を持っている酵素を多数有しているため、4℃での保存ではタンパクが分解されてしまっている可能性もあり、対策が必要である。
実験担当の学生が、コロナの影響で登校できなかったこと、教員が対応に追われたことも、進行に影響を及ぼした。
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| Strategy for Future Research Activity |
もう一つの候補遺伝子に関しては、スモールスケールでの発現確認を行い、はっきりしない場合には、微生物のタンパク質生産量を向上させる手だてとして、生産されるタンパク質の先頭11個のアミノ酸配列が同一のまま、コドンを最適化した遺伝子を使って組換えエステラーゼを生産させる方法に切り替える。また、Bacillusでの発現が難航する場合は、pColdの発現系を利用することも計画している。JT01自体からの酵素精製では、培養の容量を増やし、塩析を行った後、冷凍保存して使用する量だけを小分けにする等の対策を行い、失活を防ぐ。
各酵素の精製方法を確立し、各鎖長のPCLを用いて、低温・高圧下で活性を評価する。評価の際に比較対象に用いるH39の精製を完了しておく。目的酵素で分解可能な構造を同定するため、PCL以外の生分解性プラスチックに関しても分解能を調査する。酵素活性を常圧～加圧下で測定し、耐圧性を評価する。
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| Remarks |
18ページに国立高専における環境保全技術に関する教育・研究の事例として記載されています。
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