Study of bio-degradable plastics decomposition mechanisms in deep sea environment using recombinant enzymes

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K05819
• Research Institution: Ichinoseki National College of Technology
• Principal Investigator: 中川 裕子 一関工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (70435577)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石田 真巳 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80223006)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 深海由来細菌 / 組換え酵素 / エステラーゼ / 生分解性プラスチック / 異種発現 / PCL

Outline of Annual Research Achievements

精製方法の確立した組換えタンパクE21の大量精製を試みた。バチルスの発現系では4種類のシグナル配列の異なるベクターにクローニングしたり、様々な培養条件を試したりしたが、発現は見られなかった。また、微生物のタンパク質生産量を向上させる手立として、生産されるタンパク質の先頭11個のアミノ酸配列が同一のまま、コドンを最適化した遺伝子を使って組換えエステラーゼを生産させる方法も試みた。さらに、大腸菌の低温発現系でシャペロンを組み込んだ発現系も試した。しかし、加圧条件に必要な量のタンパクを精製することはかなわなかった。常圧では、JT01の分泌タンパクの塩析画分と比較して非常に低い活性しか示さなかったことから、低温・高圧条件では活性を持つ可能性はあるものの、目的としていた生分解性プラスチック分解酵素の主成分がE21である可能性は低いと考えられた。
また、これまでバチルスでの発現が成功していなかったE15に関しても、大腸菌の低温発現系に移行した。現在、発現条件の最適化を検討しているところであるが、あまり発現量が多いようには見えず、大量精製は難しい可能性がある。
既に文献で報告されているPCL分解酵素のH39も、発現及び精製できているタンパク量が非常に少ないことから、深海由来の細菌のタンパク質を異種発現させるには困難が伴うことが予想された。この理由を解明できれば、深海細菌の遺伝子発現の仕組みに関する知見が一気に広がる可能性がある。
さらに、PCLを基質にしたZymographyの予備実験として、プレート上でPCLの分解活性を簡易に調べる方法の開発を検討したが、こちらもあまり明確な結果を得ることはできなかった。