2020 Fiscal Year Research-status Report
異なる反応性を持つフラボノイドＣ-配糖化酵素の反応メカニズムの解明
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20K05825
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田口 悟朗 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70252070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新井 亮一 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (50344023)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | C-配糖化酵素 / フラボノイド-C-配糖体 / 酵素反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ｃ-配糖体はフラボンなどの芳香環に糖が直接炭素－炭素結合した化合物群である。その結合のため、糖の結合が化学的に安定で酸やグルコシダーゼによる加水分解を受けず、種々の生物活性を示すことから注目されている有用な化合物である。その化学合成は容易ではないため、酵素を活用した合成が期待されているが、その生合成に関わるＣ-配糖化酵素の解析は他の配糖化酵素と比べて進んでいない。本研究では、反応性の異なる植物のC－配糖化酵素がそれぞれ炭素―炭素結合を形成する仕組みを明らかにし、その比較から「Ｃ-配糖化反応」が起こる要因を解析するとともに、Ｏ-配糖化酵素とＣ-配糖化酵素の活性変換を行うなどにより、有用なＣ-配糖体の生物合成に応用することを目指している。
これまでに、ソバのＣ-配糖化酵素について立体構造を元に変異導入した酵素の解析を行い、活性に必要な残基を推定した。また、ワサビのＣ-配糖化酵素の結晶構造解析に向けたタンパク質の大量発現条件の決定のため、数種のベクターを用いてタンパク質の大量発現とその精製方法を検討した。しかし、結晶作成に用いるにはまだ不十分な状況であるため、継続して条件検討を行っている。さらに、報告されている配糖化酵素の立体構造を元にしてワサビのＣ-配糖化酵素のホモロジーモデルを作成し、活性中心付近に存在すると考えられるアミノ酸残基に変異を導入して解析を行った。その結果、そのＣ-配糖化反応に関わることが推定されるアミノ酸残基をいくつか見いだした。さらに、配列の類似性が高いワサビのＣ-配糖化酵素とＯ-配糖化酵素を比較して変異を導入し、Ｃ-配糖化とＯ-配糖化の活性の違いを生み出すアミノ酸残基の探索を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでにソバのＣ-配糖化酵素の活性中心残基の推定とワサビのＣ-配糖化酵素の結晶化のためのタンパク質調整の検討を行った。また、ホモロジーモデルに基づいてワサビのＣ-配糖化酵素の活性中心の推定と、類似したＯ-配糖化酵素との比較を開始した。しかし、新型コロナ対策のためのキャンパスの閉鎖や研究室での滞在時間の制限等により予定通りに実験を行うことができなかったこともあり、結晶作成の検討には至っていない。そのため、やや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ワサビのCGTの解析については、おおむね当初の計画に従って研究を推進する。特に、結晶化に向けた準備を急ぐとともに、本年度に開始したホモロジーモデリングをもとにした変異導入酵素の解析、並びにＯ-配糖化酵素とＣ-配糖化酵素の比較をもとにした変異導入解析を併せて推進する。
また、本年度、ソバのCGTと同じ反応性を持つCGTについて基質との共結晶を含めた立体構造解析の結果が他の研究グループから報告されたため、計画を変更し、その情報とこれまでに取得した結晶の情報を元に解析を進める。
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| Causes of Carryover |
（理由）
新型コロナ感染対策でキャンパスが閉鎖され、再開後も研究室での滞在時間が制限されたりしたこと、および、学会の中止により旅費として計画した分を使用できなかったことなどにより、予定より使用金額が少なくなった。
（使用計画）
次年度使用額は令和3年度に消耗品費と併せて使用する。
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