2023 Fiscal Year Research-status Report
異なる反応性を持つフラボノイドＣ-配糖化酵素の反応メカニズムの解明
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20K05825
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
田口 悟朗 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70252070)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新井 亮一 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (50344023)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | C-配糖化酵素 / フラボノイド-C-配糖体 / 酵素反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ｃ-配糖体はフラボノイドなどの芳香環に糖が直接炭素-炭素結合した化合物群である。その結合のため、糖の結合が化学的に安定で酸やグルコシダーゼによる加水分解を受けにくく、種々の生物活性を示すことなどから注目されている有用な化合物である。その化学合成は容易ではないため酵素を活用した合成が期待されているが、Ｃ-配糖化酵素の解析は他の配糖化酵素と比べて進んでいない状況である。本研究では、反応性の異なる植物由来のＣ-配糖化酵素がそれぞれ炭素―炭素結合を形成する仕組みを明らかにし、その比較から「Ｃ-配糖化反応」が起こる要因を解析することとともに、Ｏ-配糖化酵素とＣ-配糖化酵素の活性変換を行うことなどにより、有用なＣ-配糖体の生物合成に応用することを目指している。
本年度は、ワサビのＯ-配糖化酵素（WjGT1）の安定な変異体について、昨年度検討した方法で大量にタンパク質を調整し、結晶化スクリーニングを実施した。数百通りの条件で一次スクリーニングを行い、さらにそれらのうち結晶化の徴候が認められたいくつかの条件について最適化を行ったが、結晶の形成には至らなかった。また、昨年度までに作成したWjGT1と相同性を示すＯ-配糖化酵素をＣ-配糖化活性へ活性改変した酵素ついて、詳細な反応解析を行った。その結果をもとに、Ｃ-配糖化反応における基質の認識について検証した。また、Ｃ-配糖化活性を示さなかった変異酵素との違いについて、ホモロジーモデルを作成してその要因を考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ワサビのＣ-配糖化酵素WjGT1の結晶化では、さまざまなトラブルを解決して結晶化のスクリーニングを進めているが、結晶を得ることができていない。一方、同時に行っている点突然変異導入による酵素活性の改変は、計画に沿った形で進行している。ただ、成果の論文投稿が遅れたため、実施期間を再延長した。そのため、上記のように評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ワサビのWjGT1の構造解析については、その安定な変異体にさらに変異を導入して結晶化を試みる。また、一連の変異導入解析で明らかにしたＣ-配糖化活性に必要なアミノ酸残基がどのように反応に関与しているのかの解析を進め、論文投稿する。
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| Causes of Carryover |
(理由) 論文投稿の遅れなどにより、使用金額が少なくなった。
(使用計画) 次年度使用額は令和6年度に使用する。
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