2021 Fiscal Year Research-status Report
Characterization and application of novel dye-linked L-glutamate dehydrogenase
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20K05834
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
里村 武範 福井大学, 学術研究院工学系部門, 准教授 (50412317)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 酸化還元酵素 / バイオセンサ / 好熱菌 / グルタミン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、色素依存性グルタミン酸脱水素酵素（Dye-GluDH)活性を有する好熱菌由来新規タンパク質の機能ドメインの同定を行った。本酵素は1500アミノ酸からなるタンパク質であり、N末端側からアミドトランスフェラーゼドメイン、FMN結合ドメイン、C末端期の未知ドメインの3つの機能ドメインに分かれていることが知られている。この3つのドメインの内、どのドメインがDye-GluDH活性を有しているのかを明らかにするため、それぞれのドメインを欠損させた変異タンパク質を作成し酵素活性を測定した。その結果、FMN結合ドメインが存在している変異体のみDye-GDH活性を示した。このことより、Dye-GDH活性はFMN結合領域がその触媒活性を担っていることが明らかとなった。しかしながら、FMN結合領域のみの変異体ではDye-GluDH活性がインタクトな酵素と比較して酵素活性が低下してしまうため、バイオセンサ用素子としては、アミドトランスフェラーゼドメインを含む完全長のDye-GluDHの方が有用であることが明らかとなった。そこで、完全長のDye-GluDHを素子としたバイオセンサを構築するために、本酵素を電極に修飾したDye-GluDH修飾電極を作成した。この電極とメディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いてL-グルタミン酸の電気化学的検出を行った。その結果、L-グルタミン酸が検出できた。
次年度は、このDye-GluDH修飾電極を用いて検出限界、濃度依存性などL-グルタミン酸バイオセンサの詳細な解析を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
L-グルタミン酸の電気化学的検出が可能であることが明らかにできL-グルタミン酸バイオセンサ開発への目途がついたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
本組換え酵素のグルタミン酸バイオセンサへの応用のための電極への修飾方法の検討を進めていく。本組換え酵素はN末端、C末端にヒスチジンのタグを付加した組換えタンパク質発現系を作成しているが、C末端にヒスチジンタグを付加した組換えタンパク質のみ日建るカラムに結合することを明らかにしている。電極への酵素の配向固定は電流応答に非常に大きな影響を与えるため、C末端にヒスチジンタグを付加した組換えタンパク質の電極への配向固定の検討を進め高感度なグルタミン酸バイオセンサの構築を進めていく。
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Research Products
(1 results)
