2020 Fiscal Year Research-status Report
有用単糖の生産を目的とした多糖類資化細菌NT5株の酵素群の解析
| Project/Area Number |
20K05835
|
|---|
| Research Institution | Shinshu University |
|---|
Principal Investigator |
野村 隆臣 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (90362110)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 多糖類分解 / アルギン酸 / ペクチン酸 / リアーゼ / 加水分解 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々が独自に単離した新規細菌NT5株は多数の多糖類（アルギン酸、ペクチン質、キチン、ラミナラン、フコイダン等）の分解酵素（推定遺伝子）を保有するユニークな多糖類分解細菌であり、本研究はNT5株の酵素群を正確に理解・利用することで、バイオエタノールの実用的生産に対する基盤構築を図るものである。
実験計画当初は、【課題I】個体レベルの解析としてNT5株が分解・資化可能な多糖類を正確に把握・明確化する予定であったが、解析予定としていた多糖類のほとんどが海外輸入品であり、コロナ禍の影響で納期が著しく遅れたことから、次年度以降に計画していた【課題Ⅱ】遺伝子工学的アプローチによる解析を実施した。
ゲノム解析からアルギン酸リアーゼと推定された４種のうち、peg3971、peg3973、peg3982の３種についてリコンビナント酵素として発現・精製することに成功した。いずれもアルギン酸リアーゼとしての酵素機能を示し、基質特異性や反応速度パラメーター等の酵素的諸性質も明確にすることができた。触媒様式において、peg3971はエンド型、peg3982はエキソ型であったのに対して、peg3973はエンド型とエキソ型の両方の触媒様式を有するという興味深い結果が得られた。残る１種のpeg2754は大腸菌発現系で僅かに発現が認められるものの精製には至っておらず次年度も引き続き行う予定である。
ペクチン酸解酵素については、リアーゼ酵素として推定されたpeg44とpeg48、および加水分解酵素として推定されたpeg46はリコンビナント酵素として取得することができたため次年度に解析を進める。また、推定ペクチン酸リアーゼのpeg1716は、発現はするものの不溶化と分解が著しく見られたことから発現条件を工夫する必要があると考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で計画していた課題ⅠからⅢのうち、2020年度は当初計画で2021年度に予定してた課題Ⅱを優先して行うことになったが、律速過程と考えていたリコンビナント酵素の調製が目論見通りに成功した。一方、当初計画で2020年度に予定していた課題Ⅰについては、各種多糖類がいずれも海外輸入品であったため購入する段階で止まっているが、2021年度に実施することで十分カバーすることは可能であるため、研究全体として見るとおおむね順調に進展していると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当初計画で2020年度に予定していた課題Ⅰについて実施する。具体的には多糖類であるペクチン質（ペクチン酸とペクチン）、キチン、ラミナラン、フコイダン、キシロースを単独炭素源にした培養解析を行い、NT5株の多糖類代謝に対するポテンシャルを明確化する。なお、キチンは不溶性であるため、別途調製したコロイダルキチンを対象とする。また、培養条件が多糖類分解酵素の発現に影響を及ぼす懸念があるため、栄養（添加物）条件を変えて培養し、経時的に培養液を採取、その粘度変化を多糖類分解能の指標として評価する。なお、この解析はアルギン酸を多糖類として用いることにする。
さらに、2020年度に実施した課題Ⅱについても継続して行い、特にこれまでの解析で興味深い酵素特性を示したpeg3973（PL6アルギン酸リアーゼ）について、触媒様式に焦点を絞ったHPLC（GPCカラムを使用）を解析を行う。また、現状ではリコンビナント酵素が得られていないpeg2751（推定アルギン酸リアーゼ）とpeg1716（推定ペクチン酸リアーゼ）については、発現方法を検討し直して再度調製を試みる。
|
