2021 Fiscal Year Research-status Report
有用単糖の生産を目的とした多糖類資化細菌NT5株の酵素群の解析
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20K05835
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
野村 隆臣 信州大学, 学術研究院繊維学系, 准教授 (90362110)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 多糖類分解 / アルギン酸 / ペクチン酸 / リアーゼ / 加水分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初計画で2020年度に予定していた【課題I】個体レベルの解析に関して、解析予定の多糖類の納期がコロナ禍の影響で遅れたため、2021年度に一部の多糖類に対して実施した。結果、NT5株はアルギン酸、ペクチン、ペクチン酸を分解・資化可能であったのに対して、キチン(コロイダルキチン)は不可能であることが明確に示された。また、ラミナラン、フコイダン、キシロースについても実施したが明瞭な結果が得られなかったため2022年度も実施する。【課題II】遺伝子工学的アプローチによる解析に関して、4種のアルギン酸リアーゼのうち、興味深い触媒様式見られたpeg3973について詳細な解析を試みた。反応性生物について、TLC、GPC、質量分析を行ったところ、peg3973はエキソ型とエンド型の両特性を有する極めてユニークなアルギン酸リアーゼであることが明確に示された。また、唯一未解析として残ったpeg2754について2020年度に引き続き解析を試みたが、発現条件(宿主、温度、時間)を変えても発現・精製を達成することが出来なかった。これについては抜本的に変更を加える必要があると考えており、本研究課題期間中での達成は難しいと考えている。ペクチン質分解酵素について、2020年度にリアーゼ酵素として取得したpeg44とpeg48、および加水分解酵素のpeg46については各種酵素学的諸性質を明らかにすることができ、peg44とpeg48はエンド型、peg46はエキソ型であったことから、ペクチン質の単糖化を実証することができたと考えている。また、peg1716については発現条件を工夫しても不溶化と分解を抑えることが出来なかったため、C末端側に在る推定の触媒ドメインだけにした変異体を作製したところ、精製・機能解析することに成功し、エンド型のリアーゼ酵素であることを明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画で2021年から2022年中期の2.5年間と予定していた【課題II】について、2020年に前倒しで実施していたため、当初予定よりも早く解析を進めることができている。一方、2020年度に予定していた【課題I】については試薬の調達がコロナ禍の影響で遅れたため、2021年に実施したが、解析が一部の多糖類に留まっているため、引き続き2022年に実施する必要がある。研究全体の進捗度合いを総じて見るとおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年に解析途中であった【課題I】について実施する。具体的には多糖類であるラミナラン、フコイダン、キシロースを単独炭素源にした培養解析を行い、NT5株の多糖類代謝に対するポテンシャルを明確化する。【課題II】について、計画当初はError-Prone PCRで高機能化を図る予定であったが、peg3973が極めてユニークな酵素特性を有することが2021年の解析で明らかになったことを受けて、その作用機序の解明および高機能化を目的に幾つかの変異体を作製する。具体的には、Swiss-Modelによる立体構造予測を行い、基質結合に関連すると推定されるアミノ酸を置換する。既に、幾つかのアミノ酸に注目して変異体を作製しているところであり、引き続き解析を進めていく。【課題III】in vitro単糖生産システムの最適化については、peg3973変異体の結果を受けて実施する予定であるが、状況に応じて【課題III】よりも【課題II】を優先する(【課題II】よりも【課題II】の方が研究課題としての重要度が高いと判断した)。
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Research Products
(4 results)
