2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of physiological functions of EF-hand protein ALG-2 in lysosomal membrane damage response
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20K05837
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
牧 正敏 名古屋大学, 生命農学研究科, 特任教授 (40183610)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高原 照直 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (90708059)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | カルシウム / リソソーム / ESCRT / 近接依存性標識法 / ALIX / ALG-2 / 膜損傷 / LC-MS/MS解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（I）ALG-2はホモ二量体あるいはそのパラログであるPeflinとヘテロ二量体を形成しカルシウムイオンセンサーとして機能している。そこで、PeflinのGFP融合蛋白質（GFP-Peflin）をHeLa細胞に発現させ、リソソーム損傷誘発剤L-Leucyl-L-Leucine methyl ester（LLOMe）を処理後、GFP-Peflinの局在を観察した。その結果、ALG-2と同様にGFP-PeflinがLLOMe処理細胞においてリソソームに動員されていた。次に、Peflinノックアウト細胞とALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞を作出し、LLOMe処理後の細胞応答を検討したところ、Peflinノックアウト細胞ではLLOMe処理後のオートファジーが低下していることを見出した。また、コントロール細胞、ALG-2ノックアウト細胞、ALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞と比較して、Peflinノックアウト細胞はLLOMe処理後に細胞死を起こす細胞が増加している傾向があった。
(II) 前年度にダイズ由来アスコルビン酸の変異酵素APEX2を用いた近接依存性標識法による解析により、LLOMe処理依存的にALG-2に近接する蛋白質として同定された3種の蛋白質について、LLOMe処理後の局在を解析した。その結果、2種は損傷リソソームに同定されたが、1種はLLOMe処理の前後で顕著な局在変化は見られなかった。損傷リソソームへの局在が観察された蛋白質1種について、領域欠損変異体を細胞に発現させ、損傷リソソームへの局在を担う領域を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ALG-2のパラログでありALG-2とヘテロ二量体を形成するPeflinが損傷リソソームに動員される現象を見出し、ALG-2、Peflinそれぞれのノックアウト細胞、およびダブルノックアウト細胞を作出し、それらの損傷リソソーム応答の解析をすすめられている。、また、LLOMe処理依存的にALG-2に近接する蛋白質の中から、損傷リソソームに動員される蛋白質を同定しており、それらの機能解析をすすめられる状況にある。以上のように、本年度の研究は計画に沿って順調に進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ALG-2およびPeflinのノックアウト細胞とALG-2とPeflinのダブルノックアウト細胞において、リソソーム損傷後の細胞応答に違いが見られつつある。このことは、ALG-2ホモ二量体とALG-2とPeflinのヘテロ二量体の存在比がこれらのカルシウム結合蛋白質を介する応答に違いをもたらしていると考えられる。今後は、ノックアウト細胞にALG-2およびPeflinの野生型と変異体を発現させその表現型を解析するとともに、ALG-2とPeflinが制御する細胞応答についてカルシウム依存的に作用する標的蛋白質を特定し、分子メカニズムの解明をすすめる。また、ALG-2に近接して損傷リソソームで機能する蛋白質について、その発現抑制やノックダウンがリソソーム損傷を引き金とする細胞応答に与える影響を解析する予定である。
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