2022 Fiscal Year Annual Research Report

Elucidation of physiological functions of EF-hand protein ALG-2 in lysosomal membrane damage response

Research Project

Project/Area Number	20K05837
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	牧正敏名古屋大学, 生命農学研究科, 特任教授 (40183610)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高原照直名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (90708059)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	カルシウム / リソソーム / ESCRT / IST1
Outline of Annual Research Achievements	EF-ハンド蛋白質ALG-2を融合させたascorbate peroxidase（APEX2-ALG-2）を恒常発現する細胞株を用いた近接依存性ビオチン標識法で、リソソーム損傷刺激依存的にAPEX2-ALG-2の近傍蛋白質として同定された複数の蛋白質から、IST1について以下を解析した。 (I) IST1は、ALG-2結合蛋白質であることから、その損傷リソソームへの動員にALG-2が必要であることが予想されたが、ALG-2のノックアウト細胞でもリソソーム損傷に応答してリソソーム局在が観察された。一方で、カルシウムキレータであるBAPTA-AMを処理した細胞では、IST1のリソソーム局在は有意に減少した。（II）IST1は、ESCRT-III様の蛋白質であり、ESCRTの作用過程においてAAA型ATPaseであるVPS4A/BをESCRT-IIIの集積部位に動員する役割を担っている。そこで、IST1の発現抑制がVPS4A/Bの損傷リソソーム動員に与える影響を解析したところ、A549細胞でIST1を発現抑制するとVPS4A/Bの損傷リソソーム動員が減少した。また、ESCRT-III蛋白質CHMP4Bのリソソーム損傷刺激後のリソソーム局在を経時的に観察した。その結果、CHMP4Bのリソソーム局在がIST1発現抑制細胞では長時間に及ぶことが明らかになった。VPS4A/Bが適切なタイミングで損傷リソソームに動員されないことで、ESCRT-III蛋白質の膜からの解離が起こっていないと考えられる。 (III) IST1の発現抑制がリソソームの損傷応答に与える影響を解析した。IST1を発現抑制したA549細胞では、リソソーム損傷後のオートファジーが抑制され、また細胞死が増加する傾向が観察された。これらの結果から、A549細胞においてIST1はリソソーム損傷に対する細胞生存に必要である可能性が考えられた。