2021 Fiscal Year Research-status Report

バクテリアのゲノム情報に基づくラッソペプチドの異宿主生産

Research Project

Project/Area Number	20K05848
Research Institution	Shizuoka University
Principal Investigator	小谷真也静岡大学, 農学部, 教授 (20510621)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中川博之国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 高度分析研究センター, 上級研究員 (30308192)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	異宿主生産 / 環状ペプチド
Outline of Annual Research Achievements	中分子ペプチドは抗体と低分子の特徴を併せ持つ特性が注目され、医薬への応用が期待される。ラッソペプチドとは細菌の生産するある種の中分子環状ペプチドの総称であるプロテアーゼ耐性および生理活性を有することで創薬のターゲットとして注目されている。バクテリアゲノムにラッソペプチド生合成遺伝子は分布しているが、二次代謝産物であり通常の培養で生産されることは稀である。本研究課題は、ゲノム情報に保存されているラッソペプチドの遺伝子クラスターを用いて、新規ラッソペプチドの生産を行い、その生理活性を明らかにすることを目的とする。本年度は、生合成遺伝子をクローニングと合成遺伝子による最適化された遺伝子クラスターを構築して、研究を行った。複数のバクテリアのゲノム情報から遺伝子クラスターを選び出し、発現用ベクターの構築を行った。本年度は、特にプロテオバクテリアおよび放線菌のゲノム上に見られる環状ペプチドの生合成遺伝子を選び、遺伝子クラスター全体を発現用ベクター（pET41a, pET29b）に、組み込んだ状態で大腸菌BL21(DE3)に形質転換を行い、発現を誘導した。培養条件の中でも培地成分の組成の変化によって生産量が大きく変化することが明らかとなった。特にLB培地のような富栄養ではなく、貧栄養培地を用いた場合に、生産がみられた。また、培養温度も、23℃、30℃、37℃といくつかの温度で培養を行ったところ、23℃での生産量が最大化されるペプチドが複数あった。また、37℃では生産がほとんど見られなかった。構造決定および活性試験に必要な量のペプチドを得るために、さらなる条件検討が必要と考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、複数の遺伝子クラスターに関して、異宿主生産の試験を行うことが出来た。また、遺伝子クローニングに関しても、PCRで増幅が難しい遺伝子クラスターに関しては、合成遺伝子を外注することによって容易に遺伝子クラスターを組み込んだ発現ベクターを得ることが出来た。複数の株において、環状ペプチドを得ることが出来ており、さらに生産条件を検討することによって生産量を最大化することが可能であると考える。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究の推進方策としては、来年度はさらにクローニングする遺伝子クラスターを増やすことを考えている。また合成遺伝子もコストがかなり下がってきており、外注で得やすくなっていることから、予算の許す限り、外注で大腸菌のコドン使用頻度に最適化された遺伝子クラスターを用いて発現生産実験を行っていく予定である。また、培地成分でもペプトンのようなペプチドを含む培地で発現生産を行うと生産量が劇的に減少することから、大腸菌の細胞内で生合成されたペプチドが代謝されている可能性が考えられる。このような生産にとってのマイナスとなりえる培地成分を徹底的に除いていき、ペプチドの生産量が最大となるような培養条件の探索を行っていく。また、37℃で生産がみられなくなることから、フォールディングがうまくいっていない修飾酵素もあると考えられる。大腸菌のホストに関してもタンパクのフォールディングが最適化された大腸菌が市販品で複数存在することから、そういったホストを用いて、ペプチドの異宿主生産の最大化を行っていく。
Causes of Carryover	人工遺伝子の価格が当初より安価であったため、次年度使用額が生じた。今後の研究において必要となるペプチドの精製のためのHPLCカラムおよび有機溶媒に使用する予定である。