2022 Fiscal Year Research-status Report
Bioorganic studies on the genotoxicity of colibactin produced from human microbiome in colorectal cancer
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20K05849
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村上 一馬 京都大学, 農学研究科, 准教授 (80571281)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 抗菌活性 / 天然物化学 / コリバクチン / ヒューミマイシン / 標的探索 / プロバイオティクス / 片利共生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの腸内には多くの外来細菌が生息し，細菌―宿主間や細菌―細菌間の相互作用によって片利共生関係が成立している．片利共生において様々な代謝産物が腸内細菌により産生される一方，これらの代謝バランスが破綻するとがんや糖尿病，神経変性疾患等の発症につながると考えられている．腸内細菌が天然物・2次代謝産物（「バイオーム分子」と命名）を生産していることは50年以上前から示唆されているにも関わらず，構造や生理活性などその実体は不明な点が多い．本研究では，大腸菌が生産するコリバクチンおよび放線菌が生産するヒューミマイシン類をその作用機構研究の対象とし，合成および構造活性相関の解析，ならびに標的物質群（タンパク質および核酸）の基盤解明を行うことを目的としている．ヒューミマイシンAは，ヒトに共生している病原性バクテリア (Rhodococcus spp.) のDNA配列から，Bradyらが非リボソームペプチド合成酵素の遺伝子クラスターに着目し，合成生物学的な手法によって得たリポペプチドである．ヒューミマイシンAは，メチシリン耐性黄色フドウ球菌感染症に対して抗菌活性を示したが，同様の活性を示す従来の抗菌剤の多くはβラクタム系低分子であるため，その作用機構の解明は新しい創薬リードの開発につながる．昨年度までに，ヒューミマイシンアイソフォームがDNA結合能を示したことから，今年度は生物活性の作用メカニズムの知見を得るために，これらの抗菌試験およびトランスクリプトーム解析を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
黄色ブドウ球菌と同じくグラム陽性菌を用いてヒューミマイシンの生育阻止能をハローテスト法あるいは液体培養法で調べた．その結果，ヒューミマイシンAの脂肪酸部分の立体化学が異なるヒューミマイシンAは100 μg以上で生育阻止円を形成したが，ヒューミマイシンAアイソフォームの処理群では400 μgを添加しても観察されなかった．興味深いことに，これらの抗菌活性は相加的に増大することがわかった．次に遺伝毒性の関与を調べるために，モデルプラスミドを用いてDNA結合能をゲルシフト法により調べたところ，DNAへの付加体形成が示唆されるデータが得られ，抗菌活性との相関が明らかになった．これらの結果より，抗菌活性におけるヒューミマイシンAの脂肪酸部分が重要である可能性がある．次に，標的核酸の網羅的解析を目的としてRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を計画した．しかしながら，グラム陽性菌からのtotal RNAの抽出効率が予想以上に低かったことから，現在，抽出条件を種々検討している．以上より，今年度は和文雑誌において成果発表を行ったものの，当初の目的であった作用メカニズムの解析が完了しなかったことから，やや遅れていると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
まず加熱や変性剤，破砕ビーズの使用を検討することによって，グラム陽性菌からのtotal RNAの抽出方法を確立する．その後，次世代シーケンサーによるRNA-seq法を用いて網羅的に探索する．それと同時に，グラム陰性菌も含めた複数の菌種に対する抗菌活性を調べることによって，多剤耐性菌に対する抗菌活性を示すための標的分子に関する知見を得る．なお，total RNAの抽出効率に難航する場合は，ヒューミマイシンAをビオチン修飾した分子プローブを合成した後，細菌抽出液からペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）法によって標的分子を探索し，タンパク質レベルでの作用機構の解明に目的を切り替えることも視野に入れながら研究を推進する．
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| Causes of Carryover |
上述の理由により研究計画にやや遅れがあるため，次年度使用額が生じた．次年度使用額は，抗菌活性や次世代シーケンサー測定の費用に計上しており，次年度中に研究計画を完了させることを予定している．
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