ケミカルジェネティクスによるミズクラゲの変態制御シグナル分子群の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05851
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 国吉 久人 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 准教授 (60335643)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒川 賢治 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (80346527)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミズクラゲ / 変態 / 生理活性物質 / RNA-seq解析

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究の目的は、ミズクラゲにおけるポリプ(固着性の幼生)からクラゲ(遊泳性の成体)への変態過程を制御する内在性の細胞間シグナル分子群を明らかにすることである。具体的には、以下の３つのstepで実験を進める。
Step 1. 放線菌・糸状菌の菌株ライブラリーを探索源として、様々な変態調節活性を示す物質をスクリーニングし、精製・単離・構造決定する。
Step 2. Step 1で得られた変態調節物質の投与群とコントロール群について次世代シーケンサーによるRNA-seq解析を行い、投与によって発現変動する遺伝子群を同定する。
Step 3. Step 2で得られた変態関連遺伝子群について発現解析と機能解析を行い、変態制御に関わる細胞間シグナル分子群を明らかにする。
現在までにStep 1の「変態調節物質のスクリーニングと同定」に着手し、放線菌ライブラリーのスクリーニングで最も強い分節形成阻害活性を示した6047株について、活性物質の精製と構造解析を進めている。前年度、2つの活性画分のうち6047Bが構造決定に至らなかったため、再度大量培養を行い、大量精製を試みた。しかし、精製途中で酸化によるロスが大きく、十分な量が得られなかったため、NMR解析では部分構造の推定に留まった。
Step 2の「RNA-seq解析による変態関連遺伝子群の探索」では、過去の研究で変態停止活性が見出されたtryptamine(TAM)についてRNA-seq解析を開始した。TAM投与群・非投与群のストロビラそれぞれの口側半分と足側半分からRNAを調製し、外部受託サービスを利用して次世代シーケンサーによる塩基配列分析を行った。得られた配列データについてDDBJウェブサイトを利用してバイオインフォマティクス解析を行い、各サンプル間で発現量を比較して発現パターンの分類を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2021年度は新型コロナウイルスの感染拡大防止のために大学内への入構規制などがあり、実験に用いるミズクラゲのポリプ・ストロビラの飼育規模を制限せざるを得なかった。さらに、研究科の大規模な改修工事と重なり、半年近く生物飼育室や実験室が使用できなかった。そのため、バイオアッセイ用のポリプ・ストロビラが慢性的に不足し、活性物質の精製も迅速に進めることができなかった。このことが原因で、サンプル保存中の酸化による活性物質のロスが大きくなり、構造決定に十分な量の生成物を得られなかった。
そのような状況下であったので、Step 2の「RNA-seq解析による変態関連遺伝子群の探索」を開始し、なるべく実験作業を必要としないバイオインフォマティクス解析を中心に研究を進めた。

Strategy for Future Research Activity

【Step 1：変態調節物質のスクリーニングと同定】構造決定まで至らなかった6047Bについては、バイオアッセイの体制を十分に整えた上で再度大量精製を試み、十分量を単離して構造決定を達成したい。特に、精製過程での酸化によるロスが問題になったので、精製とバイオアッセイの連携をできるだけスムーズにして、迅速に単離に至ることを心掛ける。必要であれば、脱酸素剤や還元剤の利用も検討する。また、6047株以外の菌株についても、活性物質の精製・構造決定を進めていく。
【Step 2：RNA-seq解析による変態関連遺伝子群の探索】既に着手しているTAM投与群・非投与群のRNA-seq解析について、発現量が変動する遺伝子群の絞り込みを進める。それらの遺伝子群の推定アミノ酸配列についてシグナルペプチドの有無を検証し、分泌タンパク質遺伝子を選別して「細胞間シグナル分子候補遺伝子」とする。
【Step 3：変態関連遺伝子群の発現解析と機能解析】Step 2で細胞間シグナル分子候補遺伝子群が得られれば、それらについて順次in situ hybridizationによる発現解析を進めていく。

Causes of Carryover

2021年度は新型コロナウイルスの感染拡大防止のために大学内への入構規制などがあり、実験に携わる学生の研究室への入室と研究活動が大きく制限された。さらに、研究科の大規模な改修工事と重なり、半年近く生物飼育室や実験室が使用できなかった。そのため、当初予定していた実験を十分に実施できなかった。
具体的には、実験に用いるミズクラゲのポリプ・ストロビラの飼育規模を縮小せざるを得ず、飼育用器具類・飼料の新規購入の必要が生じなかった。飼育規模縮小の結果、バイオアッセイ用のポリプ・ストロビラが不足傾向にあり、改修工事で半年近くウェットな実験ができなかったことも加わり、実験に必要な試薬類・消耗品類や構造解析の機器使用の経費が予定よりも大幅に少額となった。2022年度では2021年度に実施できなかった実験を行う予定であるので、これらの必要経費の余剰分を2022年度に繰り越した。
2022年度では、バイオアッセイ用、遺伝子解析用のポリプ・ストロビラが大量に必要となるので、その飼育用器具類・飼料の経費として使用する予定である。それに加えて、活性物質の精製やin situ hybridizationも行うので、実験試薬類・消耗品類や構造解析の機器使用料の経費として使用する。また、9月に参加予定の日本動物学会全国大会が対面式で開催される場合を想定して、交通費・宿泊費として使用する予定である。