新規生合成酵素から迫る活性イオウ種の植物における生理機能解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05860
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 解良 康太 東京農業大学, 応用生物科学部, 助教 (30644546)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 活性イオウ分子種 / 藍藻 / シロイヌナズナ / 光合成

Outline of Annual Research Achievements

１．昨年度作製したペプチド抗体を用いて、藍藻およびシロイヌナズナの粗酵素抽出液に対する特性の検討を行った。複数のバンドが検出されたが、非特異的な結合のため、システインパースルフィド生合成酵素の特異的な検出はできなかった。
２．藍藻およびシロイヌナズナ由来のシステインパースルフィド生合成酵素を大腸菌で異種発現させ、精製後に活性測定を行った。しかしながら、発現量が少なく、活性も低いことからネガティブコントロールと比較し、有意な活性を検出できていない。また、植物ではこれまでに報告のない硫化水素キノン酸化還元酵素についてアミノ酸配列から候補を推定し、大腸菌による異種発現系を構築した。
３．シロイヌナズナにおけるシステインパースルフィド生合成酵素の発現組織解析を行うために、昨年度作成したGUSレポーター遺伝子発現コンストラクトを用いて形質転換を行った。現在は、T2種子の取得のために世代をまわしている。
４．相同組み換えにより、藍藻におけるシステインパースルフィド生合成酵素の欠損株の作製を進めた。システインパースルフィド生合成酵素は生命維持に必須であるため、まず、過剰発現プロモーター又はネイティブプロモーター制御下で部位特異的変異導入を行ったシステインパースルフィド生合成酵素（CARS活性特異的変異タンパク質）を発現させるコンストラクトを作製した。これらの配列を染色体上のニュートラルサイトに導入することで、変異タンパク質発現株を作製した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

酵素機能解析のために、大腸菌を用いたタンパク質の異種発現を行ったが、解析に必要な可溶化したタンパク質の取得に問題を抱えている。また、作製したペプチド抗体の特異性が低いため、植物におけるシステインパースルフィド生合成酵素の検出方法を再検討している。

Strategy for Future Research Activity

１．システインパースルフィド生合成酵素および硫化水素キノン酸化還元酵素についてin vitroでの活性測定を進める。
２．作製した変異タンパク質発現株を用いて、CPRS活性特異的欠損株の作製を進める。
３．作製した藍藻の変異株を用いて、光合成におけるシステインパースルフィド生合成酵素の機能解析を進める。
４．植物における活性イオウ種の生理機能を解析するために、光合成を活発に行う葉に着目した成分分析を行う。若い葉と古い葉から成分抽出を行い、LC-MSによる成分分析を行う。特に活性イオウ種や含イオウ成分に着目する。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスの影響で学会がオンライン開催になったため、旅費の支出が大幅に減少したため。