2022 Fiscal Year Annual Research Report
植物の新規ニトロ基合成酵素の分布と基質認識に関与する構造の解明
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20K05861
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| Research Institution | Toyama Prefectural University |
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Principal Investigator |
山口 拓也 富山県立大学, 工学部, 助教 (00748527)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ビワ / CYP94A / シトクロムP450 / 脂肪酸水酸化酵素 / ニトロ基合成酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物が生合成する二次代謝産物は莫大な構造多様性を有している化合物群である。ニトロ基は医農薬品などの人工の化合物に頻繁に含まれる官能基であるが、天然物においては非常に少なく、植物のニトロ基合成酵素は未解明であった。ビワの花から見出した新規シトクロムP450 (CYP94A90) はフェニルアセトアルドキシムを(2-ニトロエチル)ベンゼンに変換する新規ニトロ基合成酵素である。だが、CYP94Aファミリーは脂肪酸ω水酸化酵素として知られており、双子葉植物に広く保存されている。そこで本研究の目的は、CYP94A90とビワ以外の植物由来CYP94Aの脂肪酸ω水酸化活性とニトロ基合成活性を検出し、さらにCYP94A90の基質認識に関与する構造を解明することである。
これまでに複数の植物由来CYP94Aの活性を評価し、異種発現系を検討してきた。その結果、ウメ由来CYP94Aが大腸菌において良好に生産できることを明らかにした。そこでウメ由来CYP94Aをモデル酵素として機能解析を行った。ウメ由来CYP94Aをヒスタグ融合タンパク質として大腸菌で生産し、精製した。脂肪酸（ミリスチン酸）とフェニルアセトアルドキシムの基質結合差スペクトルを測定した結果、ミリスチン酸はType I、フェニルアセトアルドキシムはType IIのスペクトル変化を示した。すなわち、アルドキシムの窒素原子がヘム鉄に配位することが示唆された。この結果はホモロジーモデルとフェニルアセトアルドキシムのドッキングシミュレーションの結果と一致した。また、基質濃度を変化し、結合親和性を評価したところ、ミリスチン酸に対するKdは40 uM、フェニルアセトアルドキシムに対しては4.6 mMと推定された。このようにウメ由来CYP94A91のミリスチン酸とフェニルアセトアルドキシムに対する結合親和性は大きく異なることが明らかになった。
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