2021 Fiscal Year Research-status Report
セサモールによるアポトーシス誘導（抗がん作用）における構造活性相関の機能解明
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20K05880
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
藤村 務 東北医科薬科大学, 薬学部, 教授 (70245778)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | セサモール / セサモール誘導体 / アポトーシス誘導 / 細胞増殖抑制 / 抗がん作用 / 構造活性相間 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
機能性表示食品の概念が提出されて以来、世界的に健康食品が開発され、その利用度が高まっている健康機能性食品に注目した。特に、ゴマは古来より健康を増進する食品として広く親しまれてきており、最近、ゴマに含まれるゴマリグナン類は抗酸化作用など生理活性物質として注目されているが、科学的根拠に基づいた機能解明については不明な点が多い。ゴマリグナン類の中でもセサモールがK562細胞（ヒト慢性骨髄性白血病 / K562 ）およびドキソルビシン薬剤耐性K562細胞 ( K562/DOX ）に対して最も強いアポトーシス誘導（抗がん作用）を示しことを見つけた。更なるセサモールの機能解明の為に、セサモールによるアポトーシス誘導（抗がん作用）に構造活性相関があるかセサモール誘導体（S1, S2, S3）を合成し検討した。その結果、セサモール誘導体3(S3)はK562細胞あるいはK562/DOX細胞に対してアポトーシス誘導（抗がん作用）を示した。注目すべき点はK562/DOX細胞に対してもS3はセサモールよりも強いアポトーシス誘導（抗がん作用）を示した。アポトーシスが起こる際に確認できるタンパク質、PARPとその切断産物Cleaved PARP、Caspase3とその切断産物Cleaved Caspase3、がん抑制遺伝子の一つとしても知られるp53の存在も確認できた。これらのことから、細胞増殖抑制作用機構としてアポトーシスのシグナル伝達が起こったと考えられる。更にセサモール及びS3によるアポトーシス誘導のメカニズムを解析するためにLCMS/MSの解析を行った結果、セサモール及びS3によるアポトーシス誘導に共通して増減する複数のタンパク質を同定、定量した。同定したタンパク質のウエスタンブロットを行った結果、細胞死の増加と共にシグナルの増強が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在まで、私はK562細胞あるいはK562/DOX細胞を用いてセサモールおよびセサモール誘導体のアポトーシス誘導（抗がん作用）に着目し、構造活性相関におけるアポトーシス誘導（抗がん作用）の機能解明を①タンパク質の網羅的な解析(タンパク質発現解析)の同定と定量を２つの方法を用いて行った。1) SWATHTM with MS/MS法(非標識法)、2)iTRAQ法(標識法)。その結果、セサモール及びS3によるアポトーシス誘導に共通して増減する複数のタンパク質を同定、定量した。同定、定量したタンパク質が相互作用しているか免疫沈降法を用いて確認した結果、相互作用していることが確認できた。②セサモール誘導体の合成と評価：-OH、-NH2基以外の官能基を持つセサモール誘導体を有機化学合成する。抗酸化作用の評価は酸化還元活性を利用する電気化学検出法(サイクリックボルタンメトリー)により評価する。予備実験の結果、S3(-NH2)>>セサモール(-OH)>S2(-OCH3)=S1(官能基無)の順で酸化還元活性が有り、アポトーシス誘導の結果と一致していた。新規誘導体の合成を行い、細胞増殖抑制作用及びアポトーシス誘導関連タンパク質をウエスタンブロットで確認した。その結果、S3より強い活性を示す新規誘導体はなかった。
③不死化ヒト肝細胞を用いてセサモール及びS3処理の細胞毒性評価を評価した。未処理群と比較して細胞死や形態的変化などは見られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ここまでの知見を踏まえて今後、次のことを明らかにする①タンパク質の網羅的な解析(タンパク質発現解析)の同定と定量した結果から、それらタンパク質が相互作用しているか免疫沈降法やSPRなどを用いて検討する。②S3(-NH2)>>セサモール(-OH)>S2(-OCH3)=S1(官能基無)の順で酸化還元活性が有り、アポトーシス誘導の結果と一致していた。更に新規セサモール誘導体を合成し活性測定を行う。③毒性評価の解析：毒性評価は、正常細胞としてラット由来の胸腺細胞を使用する。→ ラット（オス、8-12 weeks、Wistar）から取り出した胸腺細胞を用いてプロピディウム染色によるフローサイトメーター法により測定し、細胞致死率と細胞シュリンク率により評価する。更に幹細胞以外の不死化ヒト細胞を用いてセサモール及びS3処理の細胞毒性評価を評価する。
④in vivo 評価の解析：マウスを用いたin vivo実験により、セサモールおよびセサモール誘導体処理による担がんマウスへの延命効果や健常マウスへの影響（副作用など）を明らかにする。1) マウスにがん細胞（K562あるいはL1210細胞）を腹腔内投与し担がんマウスを作製後、セサモールおよびセサモール誘導体を腹腔内投与に投与し延命効果（抗腫瘍効果）を対照群（生理食塩水投与）と比較する。2) セサモールおよびセサモール誘導体投与による健常マウスへの影響を評価する。
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| Causes of Carryover |
（理由）本研究を申請するにあたり計上した研究費については、消耗品を主体とした費用が大部分を占める。網羅的なプロテオーム解析（タンパク質発現解析） を２つの方法を用いて行った。S3よりもアポトーシス誘導の強い新規誘導体の合成を行う。セサモールの新規誘導体を合成や活性測定及び毒性の評価に繰り越し研究費を充てる（使用計画）今年度は網羅的なプロテオーム解析で得られた結果を基にアポトーシス誘導に関連する分子（タンパク質）を、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、ELISA法などにより相互作用を解析する。更に、セサモールの新規誘導体を合成し活性測定を行う。また、複数の不死化ヒト細胞を用いて毒性の評価も進める。その為、関連する消耗品費代がかなり必要になることから令和3年度未使用分の150万円+令和4年度分80万円、計230万円（直接費）を計上する。
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[Journal Article] Catalysis of electro-oxidation of antibiotics by nitroxyl radicals and the electrochemical sensing of vancomycin2021
Author(s)
Tetsuya Ono , Kyoko Sugiyama, Sachiko Komatsu, Masayuki Kumano, Kentaro Yoshida , Takenori Dairaku , Tsutomu Fujimura, Yusuke Sasano b, Yoshiharu Iwabuchi , Yoshitomo Kashiwagi , Katsuhiko Sato
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Journal Title
RSC Advances
Volume: 11
Pages: 21622-21628
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Electrochemical evaluation of nitroxyl radical catalysts and electrochemical detection of cyclosporin A2021
Author(s)
Sachiko Komatsu, Yusuke Sasano , Kyoko Sugiyama, Kazuhiro Watanabe, Masayuki Kumano, Kentaro Yoshida , Tetsuya Ono , Yoshiharu Iwabuchi , Tsutomu Fujimura, Katsuhiko Sato, Yoshitomo Kashiwagi
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Journal Title
International Journal of electrochemical science
Volume: 16
Pages: 20127
Peer Reviewed
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