細胞表層工学を用いたアレルゲンコンポーネントに対する抗体の簡便な選別法の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05889
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 大野 敏 岐阜大学, 工学部, 准教授 (10345796)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 表層工学 / 抗体

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、表層工学を利用し，特定のタンパク質に対する抗体の簡便な選別系の構築のため、そのモデル選別系の構築を進めた. 具体的には文献調査から，精子に含まれる受精に関するタンパク質(IZUMO)と ，ブレビバチルス菌で分泌発現が確認されているIZUMOに特異的なVHH抗体を選択した。まずはじめに、Hisタグ融合IZUMOタンパク質の大腸菌での産生系を構築し、IZUMOタンパク質を回収した。次に、文献の通りIZUMO特異的VHH抗体が分泌発現可能かの検証を行った。分泌産生を確認する為に、VHH抗体のC末端側にSNAPタグを融合したベクターを作製し、発現操作を行った。その結果、SNAPタグを利用した蛍光修飾が確認できたことから、IZUMO特異的VHH抗体のブレビバチルス菌で分泌産生が確認できた。次に、VHH抗体のC末端側に、固定化反応に利用するSortase 認識配列を融合するように発現ベクターを構築し、ブレビバチルス菌表層への固定化を検討した。培養後、認識配列の上流に導入したTEVプロテアーゼ認識配列を利用して、VHH抗体が切り出されるかを確認した。その結果、プロテアーゼを加えた時のみVHH抗体の分子量に相当するタンパク質が確認され、またHisタグ融合IZUMOタンパク質との相互作用が確認できた。これと並行し、選別の対象とするトロポミオシンの大腸菌での産生系を構築し、エビ由来トロポミオシン、カニ由来トロポミオシン、ダニ由来トロポミオシンなど各種トロポミオシン・タンパク質を回収した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Hisタグ融合IZUMOタンパク質やIZUMOに特異的なVHH抗体の産生、およびVHH抗体固定化ブレビバチルス菌の作製について検討を進められたが、現在までに、通常のブレビバチルス菌とVHH抗体固定化ブレビバチルス菌を混合した菌体混合物からVHH抗体固定化ブレビバチルス菌の選別条件が決定できていない。

Strategy for Future Research Activity

効率的に選別を可能とするため、当初予定していた磁気ビーズを用いた選別に加え、蛍光タンパク質融合IZUMOタンパク質を調製し、セルソーターを利用した選別系を検討する。

Causes of Carryover

研究の進捗状況により、消耗品の購入が抑えられたため、次年度使用額が生じた。
次年度使用額はセルソータを用いた選別に関する消耗品などの購入に使用する予定である。