細胞表層工学を用いたアレルゲンコンポーネントに対する抗体の簡便な選別法の確立

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05889
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 大野 敏 岐阜大学, 工学部, 准教授 (10345796)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 表層工学 / 抗体 / ソルターゼ

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、抗IZUMO重鎖抗体を提示した菌体と蛍光標識されたIZUMOを混合後、セルソーターを用いて蛍光標識された菌体を分別する手順で、ターゲット分子による重鎖抗体提示菌体の分子選別のモデル系構築を進めた。セルソーターにて選別するまでの混合洗浄操作などの条件、選別における条件を検討したが、良い未提示菌との選別条件は設定できなかった。そのため、プロモーターの変更、分泌シグナルの変更、重鎖抗体とソーティングシグナルとのリンカー配列の変更など、ベクター構成の検討を進めている。並行して、細胞表層への固定に用いるSortase 認識配列の検討を行うために、ブレビバチルス菌由来Sortaseの調製と機能解析を行なった。調製の際は黄色ブドウ球菌由来Sortaseの機能解析報告を参考に、N側領域を欠失させた変異体(Sortase Δ1-39)も調製した。ソーティングシグナルモチーフとしてLPQTGの配列を組み込んだ一次基質とSortaseを混合、保温し、電気泳動した。一次基質の消費量やC末ペプチドを欠失した一次基質量、アシル酵素中間体量を電気泳動後の染色結果から確認し、Sortase活性の指標とした。その結果、SortaseのN末端を欠失することにより活性が上昇し、活性に重要と推定される94位ヒスチジン残基、155位システイン残基をアラニンに置換すると活性が低下した。合わせて、ソーティングシグナルモチーフ配列として、LPQTGの配列以外にLPKTG,LPNTG, LPNTAの配列を含む一次基質を調製し、Sortaseが反応を進行させる上で有利な基質配列の調査を行った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

セルソーターを用いたターゲット分子による重鎖抗体提示菌体の分子選別においては、条件が設定できておらず、Sortaseが反応を進行させる上で有利な基質配列の調査を基に、プロモーターの変更、分泌シグナルの変更、重鎖抗体とソーティングシグナルとのリンカー配列の変更など、ベクター構成の検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

セルソーターを用いたターゲット分子による重鎖抗体提示菌体の分子選別においては、ベクター構成の検討において、表層への固定量を測定できるようペプチドタグや配列特異的プロテアーゼ認識配列を導入するなど、検出、測定を容易にする。また、アレルゲンコンポーネントの一つであるBetv1とそのVHH配列を参考に、この組み合わせでの選別を行い、選別条件の検討を進める。
Sortaseの機能解析においては、電気泳動を利用した定性的な解析から、蛍光基質へ変更し、定量的な解析を行う。合わせて、ブレビバチルス菌由来SortaseはclassDに分類されており、より機能解析が進められているclassA酵素との比較を進める。