2020 Fiscal Year Research-status Report
農作物特異的新規マルチコピーDNAマーカーのバイオインフォマティクス的探索と応用
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20K05901
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
曽我 慶介 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 主任研究官 (50746336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 光範 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 主任研究官 (70772630)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | リアルタイムPCR / トウモロコシ / リボソームDNA / ITS / マルチコピーDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食品表示偽装や加工食品からの異物混入検知を目的とした農作物の高感度かつ特異的DNA検出法を開発するために、マルチコピーのDNAマーカーを探索する。
今年度はトウモロコシをモデル作物とし、タンデムリピートを成すことからマルチコピーであることが知られるリボソームRNA（rRNA）の遺伝子領域から目的に適うようなDNA配列を探索した。真核生物のrRNAは主に18S、5.8S、28Sのサブユニットから構成されるが、その各サブユニットのスペーサー領域のinternal transcribed spacers (ITS)領域は進化速度が速く、種間でも多様性に富む配列であることが知られている。そこでITS領域を対象としたBlastを用いた20種以上の作物における相同性解析において、多様性に富む候補領域ピックアップした。その領域において、トウモロコシの品種間で多様性が無いことを10種類の品種を用いたシークエンス解析によって確認した。DNAの検出にはリアルタイムPCRが有用であることから、その増幅に適した100 bp前後で特異性の高い領域でプライマーおよびTaqManプローブを設計し、30種以上の作物DNAを用いて特異性の確認を行った。ゲノムDNA（50 ng）を鋳型に用いたリアルタイムPCRではトウモロコシではCt値約13であったのに対し、その他の作物では検出されないまたはCt値35以上で検出された。本研究で新たに設計したリアルタイムPCR法ではトウモロコシを高感度に検出可能なことが示唆されたが、特異性の改良については今後さらなる検証が必要と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、緊急事態宣言等の影響において、実験量は少なくなってしまったが、解析ツールを用いた検証を主に行うことで当初想定していた解析を行うことができた。そして、トウモロコシをモデル作物として、リボソームRNAのITS領域に着目した相同性解析による高感度な農作物DNA検出法の開発を検討し、その戦略が高感度な作物検出法開発に有効であることを示すことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に有効に機能した高感度検出法の開発法を用いて、ダイズなどのその他の作物でも開発が可能か検証を行う。また、トウモロコシの高感度検出法を用いて、加工食品からのDNA検出を試みる。またCt値35以上で検出されたことから、非特異的な増幅による検出が起こらないようなリアルタイムPCRの条件を検討する。
また、バイオインフォマティクス解析ツールを用いたより効率的なマルチコピーDNA探索法を検討する。
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| Causes of Carryover |
緊急事態宣言等の影響で実験実施期間が短くなり、コンピュータによる解析を主に行ったことから実験量が少なくなったため、使用する消耗品は実験室ストック分で大部分を賄うことができた。実験で使用する試薬等は次年度以降に繰り越して購入するにする。
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