2022 Fiscal Year Research-status Report
農作物特異的新規マルチコピーDNAマーカーのバイオインフォマティクス的探索と応用
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20K05901
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
曽我 慶介 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 主任研究官 (50746336)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 光範 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 主任研究官 (70772630)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 遺伝子検査 / マルチコピーDNA / 遺伝子マーカー / リアルタイムPCR / コメ / トウモロコシ / 加工食品 / バイオインフォマティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、食品表示偽装や加工食品からの異物混入検知を目的とした農作物の高感度かつ特異的DNA検出法を開発するために、マルチコピーのDNAマーカーを探索する。
昨年度までに検討していたトウモロコシのリボソームDNAのマルチコピー領域を標的としたリアルタイムPCR（プローブ法）による検出法では、ダイズでわずかに交差反応を示した件で、同様に加工品で混入しうる作物についても検証を行ったところ、ブルーベリー及びカカオでも40未満のCq値で検出されることがわかった。リボソームDNA領域を対象とした場合豆類で交差反応を示す傾向があり、今後特異性の改善の際に考慮が必要なことが確認された。
さらに日本人の主食でかつDNA解析データが比較的多いコメをモデル作物としてマルチコピーDNAマーカーを探索するために、NCBIのデータバンクに登録されているコメに関するデータを用いて検討を行った。マルチコピーでかつBLASTプログラムによる相同性による特異性のフィルターをかけた配列をピックアップし、それぞれ100bp以上のアンプリコンを生成するようなPCRプライマーペアを複数設計した。設計プライマーを用いてリアルタイムPCR（インターカレータ法）による特異性確認を行ったところ、従来のシングルコピー遺伝子を標的とした場合より、感度は改良されるが、大豆にも交差反応を示した。現在、特異性改善に向けて、ダイズと交差反応する原因を解析している。また、今後は塩基配列以外のデータ利用の検討も模索していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コメおよびトウモロコシをモデルに作物特異的なマルチコピー遺伝子を標的としたリアルタイムPCRを検討したところ、従来のシングルコピー遺伝子を標的とした場合より、感度が大幅に改良されることが確認できている。一方で、その他作物にも交差反応を示すことも問題となっており、今後その対策を講じることが必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
リアルタイムPCRで交差反応を示す理由は、標的種以外の作物ゲノム上にも標的配列と似た配列を有するためと考えられるが、登録されている塩基配列のデータベースを参照するBLASTプログラムだけでは非特異的な配列の存在を察知できないこともあり、登録種のバリエーションやシークエンスの困難な領域のデータ不足を考慮すると限界がありそうである。今後は塩基配列以外のデータも利用を検討していく予定である。
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| Causes of Carryover |
従来プライマーをTaqMan法で設計していたが、SYBR法で一次スクリーニングをかけることで、プローブ購入費を最小限に抑えることができた。また、学会参加費を他の予算で補えたため、当科研費での使用を控えることができた。
次年度の追加で検討を要する実験の消耗品、および人件費に使用する。また、論文投稿費及び学会参加費に使用する。
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