2021 Fiscal Year Research-status Report
国際的整合性を満たした食品衛生検査の技能試験に利用可能なボツリヌス菌標準株の開発
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20K05904
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| Research Institution | Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine |
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Principal Investigator |
山崎 栄樹 帯広畜産大学, 動物・食品検査診断センター, 准教授 (40514708)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
茅野 光範 帯広畜産大学, 畜産学部, 准教授 (20590095)
奥村 香世 国立感染症研究所, 安全実験管理部, 主任研究官 (70415561)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 標準試験法 / 食品からの微生物標準試験法検討委員会 / ボツリヌス菌 / コラボスタディ / 妥当性確認 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）本研究では、ボツリヌス遺伝子標準試験法の妥当性および無毒化ボツリヌス株の適合性の評価を目的として、複数の試験機関による併行試験（コラボスタディ）を実施している。本年度の研究においては、昨年度までに構築した地方衛生研究所および大学から構成されるコラボスタディ組織において標準菌株を用いたボツリヌス遺伝子標準試験法の安定性および汎用性についての検証を実施した。コラボスタディの実施においては、ターゲットとなるボツリヌス菌の毒素型の多様性およびボツリヌス菌取扱いが可能な機関が限られている現状を勘案し、他の菌に適用される一般的なコラボスタディとは異なる検証スキームを構築した。すなわち、全ての機関で同一毒素型を用いたボツリヌス遺伝子標準試験法のプロトコールとしての安定性の検証を目的とするコラボスタディパートと、機関ごとに異なる毒素型を用いたボツリヌス遺伝子標準試験法の汎用性の検証を目的とするシングルスタディパートを組み合わせたコラボスタディ計画を構築した。構築したコラボスタディスキームは限られた機関で複雑な検証を実施する際のモデルケースとなるものと考えている。
２）ボツリヌス菌については法律上の取り扱い制限から、可能な限り使用機器を少なくした形でのボツリヌス遺伝子標準試験法構築が望まれる。本年度の研究では市販の簡易DNA抽出キットのボツリヌス遺伝子標準試験法への適合性について評価を行った。国内で入手可能な複数の簡易DNA抽出キットについて使用性、安全性および検出感度について評価を行い、ボツリヌス遺伝子標準試験法へ利用可能なDNA抽出キットの選定を行った。
３）本年度の研究で得られた成果について第74回（2021年10月12日）、第75回（2021年12月20日）および第76回（2022年3月15日）食品からの微生物標準試験法検討委員会において報告し、専門家からの意見徴収を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究においては、ボツリヌス菌取扱い経験が豊富な国内の複数の試験所からなるコラボスタディ組織を構築し、各機関協力のもとボツリヌス遺伝子標準試験法の妥当性に関するデータ獲得を行った。コラボスタディ実施にあたっては、コラボスタディ参加機関と密な連絡体制を構築し、過去に実施されたコラボスタディと比較して複雑な複数段階からなるコラボスタディ計画のスムーズな実施を可能としている。現在までに、ボツリヌス遺伝子標準試験法のプロトコールとしての安定性の検証（シングルスタディパート）を完了しており、加えて、ボツリヌス遺伝子標準試験法の汎用性の検証（コラボスタディパート）についてもターゲットとした4種の毒素型（A, B, EおよびF型）のうち3種についてデータの獲得を完了している。
一方で、本研究の目的の一つとしている無毒化ボツリヌス株を用いた解析については、無毒化ボツリヌス株の構築の遅れから、現在のところデータ獲得には至っていない。しかしながら、無毒化ボツリヌス株が利用できなかった場合の代替として、試験機関間の菌株移動を行わずに複数の機関で同じ水準で試験実施が可能となるスキームの構築を行っており、無毒化ボツリヌス株を使用せずともボツリヌス菌に対する食品衛生検査の技能試験を実施可能な方法論についても検討を進めている。
これらの成果は今後、食品衛生検査の技能試験について新たなモデルケースを提示し、国際的整合性を満たした形での国内における食品衛生検査技術の向上に資するものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度以降の研究においては、コラボスタディにより得られた結果に基づいたボツリヌス標準菌株を用いた際のLOD50（定性試験において特定の菌量を接種した際に陽性の結果が得られる確率を統計的に示した値であるProbability of Detectionが50%になるスパイク菌量）を算出する。一方で無毒化ボツリヌス株の作成を行い、同株を用いたシングルラボスタディおよびコラボスタディにより無毒化ボツリヌス標準菌株のLOD50を算出する。これらの結果は、2021年1月に示されたISO 16140-3 Microbiology of the food chain -Method validation- Part3: Protocol for the verification of reference methods and validated alternative methods in a single laboratoryにおいて、標準試験法を利用しようとする試験室が適切な感度で当該試験を実施する能力をもっているかを検証するための手順に必要な数値（基準値）となり、本研究が目指す国際的整合性を満たした食品衛生検査の技能試験の実施に対して重要なデータを提示するものと考える。
研究成果については食品からの微生物標準試験法検討委員会において報告し、国内の食品衛生行政等にかかわる専門家の意見を取り入れながら、今後の研究計画をすすめる。またコラボスタディ完了後には国内で使用可能なボツリヌス毒素遺伝子標準試験法として、食品からの微生物標準試験法検討委員会から公表する。
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| Causes of Carryover |
本年度は対面形式での学会開催がなかったため、旅費を中心として未使用予算が発生した。
本年度までに得られた結果を積極的に発表するために、未使用予算については次年度に繰り越して使用する予定である。
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