2022 Fiscal Year Research-status Report
脳内オピオイド産生の計測制御による過食のメカニズムの解明
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20K05933
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| Research Institution | National Defense Medical College |
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Principal Investigator |
太田 宏之 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 薬理学, 講師 (20535190)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
守本 祐司 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 生理学, 教授 (10449069)
今野 歩 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (40509048)
古賀 農人 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 精神科学, 助教 (70744936)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | エンケファリン / 摂食障害 / 過食 / 大脳基底核 / 線条体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肥満は摂食行動の「反復」によって引き起こされます。摂食行動の反復は基底核-中脳報酬系によって制御されていますが、未だその機序が完全に解明されたわけではありません。これまでの研究により、基底核の代表的な脳内オピオイドであるエンケファリンは摂食行動への関与が示唆されているものの、具体的な関連は不明でした。そこで本研究では、エンケファリンが摂食行動の反復において果たす役割を明らかにします。
実験１：エンケファリン産生遺伝子(pro-Enkephalin; PENK)のプロモーター領域を用いてAkaluc-Venusを発現させるアデノ随伴ウイルス(AAV)を作成した。腹側線条体にAkaluc-Venusが発現した。PENKプロモーター活性をAkalucの発光で計測することを試みたが、発光基質のAkalumineの血行動態が不安定なため、定量化をあきらめた。
実験２：エンケファリン産生遺伝子(pro-Enkephalin; PENK)をノックアウトすCRISPR-Cas9とsgRNAを組み込んだアデノ随伴ウイルス(AAV)を作成した。作成したAAVをマウスの大脳基底核・線条体に導入した。コントロールとしてROSA領域にsgRNAを設定した群、pro dynorphineをターゲットにsgRNAを設定した群も用意した。すべての群において線条体および行動に異常が発生し、行動実験を中断した。
実験３：shRNAによるPENKノックアウトおよびMS2-P65-HSF1によるPENK過剰発現を引き起こすAAVを作成した。PENKの過剰発現によって、運動量が減少した。
実験４：D2-creマウスを用いて、線条体のエンケファリン発現ニューロン(D2受容体発現ニューロン)をジフテリアトキシンによって除去するAAVを作成した。運動量が増加することが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時点においては、PENKプロモーター下流に発光タンパクのAkalucを発現させ、摂食行動時のPENKプロモーター活性をin vivo計測する研究計画であった。しかし、当該のコンストラクト(AAV-PENK-mCMV-Venus-Akaluc)を作成し線条体に発現させた結果、発光のin vivo計測は可能であったものの、日をまたいだ計測値が一定ではなく、定量的な解析がほぼ不可能であることがわかった。原因は、発光基質のAkalumine (i.p. or i.v.)の脳内への到達が一定ではないためであると推定された。そのため、PENKのノックアウトをCrispr-Cas9を用いて行うことで、エンケファリンの機能推定を行う計画に変更した。しかし、コントロール群も含めて線条体に何らかのダメージがあり、行動実験を中止した。代わりに、shRNAを用いたPENKノックアウト、MS2-P65-HSF1によるPENK過剰発現、ジフテリアトキシンを用いたD2受容体発現ニューロンの除去モデルを用いて、運動異常・摂食異常を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
shRNAを用いたPENKノックアウト、MS2-P65-HSF1によるPENK過剰発現、ジフテリアトキシンを用いたD2受容体発現ニューロンの除去モデルを用いて、運動異常・摂食異常を検討する。
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| Causes of Carryover |
当初計画していた遺伝子組み換え実験に失敗したため、最終年度に行動実験を行うこととなったため。
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