investigation of a novel translational regulatory mechanism based on tRNA usage

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05954
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 長尾 翌手可 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (30588017)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: タンパク質合成 / tRNA / 遺伝暗号解読 / コドン

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子の発現制御機構を解き明かすことは様々な生命現象を理解する手掛かりになる。タンパク質合成において翻訳開始過程の制御機構はよく研究されてきており多くの知見が得られている一方で、翻訳伸長過程における制御機構は未だ不明な点が多い。細胞内で進行中のタンパク質合成おいて、複数のtRNAによって解読されるコドン上では、解読するtRNA種間の存在量や特徴、あるいはコドンコンテキストによってその使用頻度が異なる可能性があり、その結果mRNAの翻訳伸長速度やリズムが調節され、最終産物であるタンパク質の量や機能に影響すること予想される。同じコドンを複数のtRNAが解読する場合、それらのtRNAはアイソデコーダーと呼ばれる。ほとんどの生物では複数のアイソデコーダーtRNAを有しているが、その使用頻度や生物学的意義については分かっていない。そこで、本研究では、翻訳中のtRNAを直接解析することによって、コドン種ごとに細胞内でのtRNA使用頻度を体系的に測定し、遺伝子上のtRNA使用頻度が、合成されるタンパク質の発現量や適切なフォールディング形成や安定性とその延長線上にある機能発現にどう関わるかを明らかにする。そして、最終的にtRNA使用頻度が関わる翻訳伸長調節機構の提唱とその検証を行う。細胞内でのアイソデコーダーtRNAの使用頻度やその存在意義に着目した研究は少なく、実際に遺伝子ごとにその使用頻度が異なるのかどうかについても分かっていないのが現状であるが、その実態を捉えることで、アイソデコーダーtRNAの役割だけでなく、遺伝子構築の進化といった根本的な課題についての理解に貢献できると考えている。また、本研究で得られた知見に基づいて、組み換えタンパク質のコドンを設計することで翻訳速度を調節しその可溶化効率を上げるといった応用性も期待できると考えている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、細胞内の翻訳伸長中に使用されているtRNAを解析し、各コドンがどのようなtRNA種によって解読され、アイソデコーダーtRNAの使用頻度の違いや、それによって生じる翻訳効率の違いや翻訳速度に与える影響を定量的に解析することを目標とする。そのため、細胞内で翻訳に用いられたtRNAを抽出し解析する必要があるが、そのような生化学的手法は確立されていない。したがって、初年度は、翻訳の際に実際に用いられたtRNAとしてリボソーム内のペプチジルtRNAを解析対象とし、その研究手法の確立を目指した。また、エピトープタグ配列の直後に検証するコドン（テストコドン）を配置したレポーター遺伝子発現系を構築し、レポーター発現細胞からペプチジルtRNA画分を抽出し、タグ配列に対する免疫沈降法によってテストコドンを解読しているペプチジルtRNAを濃縮しその解析を試みた。細胞から翻訳途中のペプチジルtRNA抽出法の確立に成功したが、レポーター遺伝子発現系を用いた系では、目的のペプチジルtRNAの濃縮は成功した一方で、非特異的に結合したとみられるデアシルtRNAやアミノアシルtRNAも多く混入していた。これらペプチジルtRNA以外のtRNAの混入は、以降の次世代シーケンスによって読まれてしまうため、免疫沈降前に電気泳動法などによってペプチジルtRNAと分離する方法を検討したが、完全に取り除くことができず困難している。また、細胞内のペプチジルtRNAの量は非常に少ないため、条件検討に必要なサンプル量を調整するのに大量培養をする必要があることも、進捗の遅れの要因となっていると考えている。

Strategy for Future Research Activity

上述した通り、本研究の遂行過程でエピトープタグペプチジルtRNAの単離調整する方法と細胞内からペプチジルtRNA調整の労力について課題が浮き上がってきた。そこで、それらの課題を解消するために、エピトープタグ配列をもつペプチジルtRNAを免疫沈降法によって精製し解析する方法を一旦中断し、各アミノ酸のコドンを1種類に限定したレポーター遺伝子を細胞内で発現させ、抽出したペプチジルtRNAのtRNA部分を配列解析することによってアイソデコーダーの使用頻度を算出する方法に取り組んだ。レポーター遺伝子を構成するアミノ酸のうちテストコドンによって指定されるアミノ酸は全てそのテストコドンになるようにレポーター遺伝子を複数種類設計した。また、この方法では、細胞内のポリソーム画分をできるだけ設計したレポーター遺伝子mRNAで占有する必要があるため、低温条件下での培養やRNA分解酵素を発現させるなどして内在遺伝子の翻訳をできる限り抑制するような解析系を試みている。また、ペプチジルtRNAのみをシークエンシングするために、抽出過程で混入したアミノアシルtRNAを銅イオンを用いて選択的にデアシル化し、その後過ヨウ素酸酸化によって3’末端を開裂することでシークエンシングに必要なアダプター結合を阻害する方法を試みており、準備実験であるが、質量分析によるアミノアシルtRNAの選択的デアシル化と過ヨウ素酸化後のtRNAのアダプター結合反応阻害効果を確認している。この方法が確立すれば、比較的少量のサンプル調整でペプチジルtRNAのみを配列解析することができ、様々なストレス条件下で培養した細胞やtRNA修飾欠損変異株などの多検体の解析を簡便に行うことができると期待している。