2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the structure-function relationship and the sugar-recognition mechanism of novel mutidomain transglucosidases acting on starch
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20K05956
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
殿塚 隆史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50285194)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 糖転移酵素 / マルチドメイン酵素 / アミラーゼファミリー / 澱粉 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ゲノム解析研究の進展により澱粉に作用する機能未知酵素が多数存在することが判明し、これらの酵素には糖の製造に有用なものが存在すると考えられる。細菌Rhodothermus marinusのRmar_0285、および、細菌Flavobacterium johnsoniaeのFjoh_1408は、ともにα-アミラーゼファミリーに属する酵素であるが、機能既知の酵素とはアミノ酸配列の相同性が低く、新規な酵素であると考えられる。また、両酵素はともに1000アミノ酸残基近くから成るが、α-アミラーゼファミリーに属する酵素の多くは、500アミノ酸残基前後のものが多く、巨大なマルチドメイン酵素である。本研究は澱粉に作用する新規酵素Rmar_0285およびFjoh_1408について、構造と機能の解析を行い、応用につなげることを目的とする。両酵素とも立体構造予測により、N末端側よりN1-N2-N3-A/B-C-Dというドメイン構成で、触媒残基はドメインA/Bに存在するあると予想されている。
本年度はRmar_0285については、ドメイン構成N3-A/B-Cの酵素について大腸菌による発現系を構築し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製を行い結晶化を行った。さらにX線回折強度測定を行い、分解能2Å程度の回折を得た。Fjoh_1408については、ドメイン構成N3-A/B-Cの酵素について大腸菌による発現系を構築し、粗酵素液の性質を調べた。その結果、マルトオリゴ糖を基質とした場合糖転移活性を示すことを明らかにした。また、本酵素と関連する、糖質に作用する酵素の構造と機能の解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Rmar_0285とFjoh_1408は、アミノ酸配列の相同性は36%で、配列の全体にわたって相同性があり、両酵素ともN末端側よりN1-N2-N3-A/B-C-Dというドメイン構成であると予想され、両酵素は同じサブファミリーに属すると考えられる。Rmar_0285においては、酵素全体の大腸菌を用いた発現系の作製を試みたが、発現はするものの精製酵素を得ることは難しかった。そこで、さまざまなドメインごとの組み合わせを試したところ、N3-A/B-Cの組み合わせでpET32aベクターに組み込んだプラスミドによる系では、良好に発現することが分かった。
Rmar_0285 N3-A/B-Cの精製は、Hisタグを用いたNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーによって行い、スロンビンプロテアーゼでタグを切断した後、イオン交換クロマトグラフィーで精製した。結晶化については、当初3Å程度の低い分解能しか得られなかったが、結晶化の条件検討を行ったところ、高エネルギー加速器研究機構BL5Aビームラインで2Å程度の分解能が得られる結晶を得ることに成功し、結晶の空間群はP21、a,b,c=64.4, 61.1, 98.6Å、β=106度であることが分かった。
Fjoh_1408についても、当初、全長の発現系の構築を試みたが発現量は低いものであったため、Rmar_0285と同様N3-A/B-Cの組み合わせでpET32aベクターに組み込んだプラスミドを作製した。粗酵素液の性質を調べ、マルトオリゴ糖を基質とした場合糖転移活性を示すことを明らかにした。
また、本酵素と関連する、糖質に作用する酵素（β-アラビノフラノシダーゼ、β-フルクトフラノシダーゼ、α-グルコシダーゼ）の構造と機能の解析を行った。
以上のとおり、立体構造の決定までには至っていないが、良質な結晶を得ることに成功しているため、上記の判断とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
Rmar_0285においては良質な結晶が得られていることから、分子置換法により得られたＸ線回折データでの立体構造の決定を試みた。しかしながら立体構造既知の酵素とのアミノ酸配列の相同性は最大でも20%程度と低く、立体構造の決定には至らなかった。今後、さまざまな重原子にソーキングした結晶の回折データの収集を行う。また、結晶は長波長のX線を用いた場合でも良好な分解能を得ることができると期待されるため、S-SAD法による立体構造決定を試みる。
Fjoh_1408については、GH13に共通して見られるドメイン構成であるA/B-Cの配列を組み込んだプラスミドによる大腸菌の発現系では、精製に至るまでの十分な発現量を得ることができなかった。このため、まずは糖結合能を有すると予想されるN1ドメインおよびN3ドメインの発現系を構築し、さらに蛍光タンパク質と融合したものの発現系を構築すことにより澱粉や各種糖との結合を測定する。
本酵素と代謝系などが関連する酵素についても、構造と機能の解析を進める。
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| Causes of Carryover |
令和2年度は予算計画に対し99%の執行と、コロナ禍のため旅費の使用がないなどで、未使用額13,426円があるものの、ほぼ計画どおりの使用である。未使用額については、令和3年度に消耗品費として使用する。
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[Journal Article] Crystal structure of a glycoside hydrolase family 68 β-fructosyltransferase from Beijerinckia indica subsp. indica in complex with fructose2020
Author(s)
Tonozuka, T., Kitamura, J., Nagaya, M., Kawai, R., Nishikawa, A., Katsuaki Hirano, K., Tamura, K., Fujii, T. and Tochio, T.
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Journal Title
Biosci. Biotechnol. Biochem.
Volume: 84
Pages: 2508-2520
DOI
Peer Reviewed
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