2021 Fiscal Year Research-status Report

Molecular basis and significance of yeast symbiosis in traditional food fermentation processes

Research Project

Project/Area Number	20K05958
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	渡辺大輔奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (30527148)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	橋本渉京都大学, 農学研究科, 教授 (30273519)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	発酵食品 / 微生物共生 / 酵母 / Saccharomyces cerevisiae / ブドウ果皮常在菌 / Aureobasidium pullulans / ω-ヒドロキシ脂肪酸 / 生もと乳酸菌
Outline of Annual Research Achievements	発酵食品の伝統的製法における原材料植物または他種の微生物との共生を担う因子の解明を目的として、以下の2つの課題に取り組んだ。 (I) ワインの自然発酵における微生物共生：前年度に実施したブドウ果皮常在菌単離実験の結果、酵母Saccharomyces cerevisiaeのようなアルコール発酵力の高い菌種は同定されなかった。一方、ブドウ果皮常在菌として単離された酵母様真菌Aureobasidium pullulansは、果皮の最外殻に位置するクチクラ層を分解するクチナーゼを分泌し、S. cerevisiaeの果肉へのアクセスを促進する。今年度は、A. pullulansがクチクラ層の分解産物であるω-ヒドロキシ脂肪酸を利用して生育できることを新たに見出し、この性質がブドウ果皮における常在性の獲得に必須な役割を有する可能性を示唆した。また、ブドウ果皮における菌叢変化を調べるためのメタゲノム解析を実施した結果、単離実験の結果と矛盾なく、Saccharomyces属の酵母は検出されなかった。ブドウ果皮にあらかじめS. cerevisiaeを少量植菌すると、S. cerevisiaeを含むSaccharomycetaceae科の酵母および近縁のSaccharomycodaceae科の酵母の優占度が上昇することを見出した。このことから、虫や風によってブドウ果皮に運ばれたS. cerevisiaeが、自身や近縁種の酵母の適応を促進するというモデルを構築した。 (II) 清酒の生もと造りにおける微生物共生：清酒の伝統的製法である生もと造りでは、乳酸菌との共存によって酵母の代謝様式が変化する。この現象に関与する酵母Tup1p-Cyc8p複合体の変異株を構築したが、乳酸菌との共存により引き起こされる表現型とは一致しなかった。今後、Tup1p-Cyc8p複合体の上流因子に着目して解析を継続する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason (I) ワインの自然発酵における微生物共生：本年度はブドウ果皮常在菌の常在性に関与する植物クチクラ層由来成分ω-ヒドロキシ脂肪酸の重要性を示唆するデータが得られた。クチクラ層はあらゆる陸上植物の地上部を覆い、他生物との相互作用の初発反応に関与すると考えられるが、本研究によりその分解産物であるω-ヒドロキシ脂肪酸を利用して生育する微生物を世界で初めて単離することができた。ワインの自然発酵に限らず、植物-微生物間相互作用の鍵を握ると考えられる新しい因子を本研究により見出したことは意義深い。また、ブドウ果皮のメタゲノム解析の結果からは、初期条件におけるS. cerevisiaeの存在が自身を含むSaccharomycetaceae科・Saccharomycodaceae科の酵母の優占度を高める正のフィードバックの存在を明らかにすることができた。ワインの起源におけるS. cerevisiaeの存在理由の解明の大きな手掛かりとなる微生物間相互作用であると期待される。本研究課題全体の目標達成に向けての方向性を示す重要な研究成果を得るに至った。 (II) 清酒の生もと造りにおける微生物共生：乳酸菌との共存による酵母の代謝改変に酵母Tup1p-Cyc8p複合体が直接関与することを想定して研究を進めたが、本年度の実験結果から予想とは異なることが判明した。このことから、乳酸菌はTup1p-Cyc8p複合体の上流因子を直接的な標的として作用することでTup1p-Cyc8p複合体の状態を変化させている可能性が示唆される。微生物間相互作用の分子メカニズムの解明に向けての新しい指針が示された。
Strategy for Future Research Activity	(I) ワインの自然発酵における微生物共生：これまでにブドウ果皮常在菌A. pullulansのクチクラ層分解性・資化性を明らかにすることができたため、その分子基盤の解明を目指す。具体的には、A. pullulansの全ゲノム解析を実施し、分解・資化に関連する遺伝子を同定する。また、ω-ヒドロキシ脂肪酸を利用して生育することのできる他のブドウ果皮常在菌についても探索を行う。以上の解析により、ブドウ果皮における常在性を示す微生物とそのメカニズムを明らかにする。今年度までに見出したブドウ果皮におけるS. cerevisiaeの出現メカニズムと組み合わせることで、ブドウ果皮由来成分、ブドウ果皮常在菌、S. cerevisiaeの三者間の相互作用に関する統合的な理解に至る。 (II) 清酒の生もと造りにおける微生物共生：新たな解析対象とするTup1p-Cyc8p複合体上流因子の遺伝子破壊株を生もと乳酸菌と共存させ、代謝改変への影響を調べる。また、これまでの解析では乳酸菌が酵母のグルコース抑制に及ぼす作用に特化した解析を行ってきたが、これ以外の多様な代謝改変を誘発する可能性についても検討を行い、新たな研究シーズを探索する。代謝レベルでの微生物間相互作用の全体像を明らかにするため、メタボローム解析も活用しつつ手掛かりを得たい。
Causes of Carryover	2021年12月の大学の異動に伴い、研究を中断した時期が生じたため次年度使用額が生じた。主に、実験に係る試薬・消耗品類の購入費用（物品費）に用いる予定である。