2020 Fiscal Year Research-status Report
真核生物のリボソーム合成制御の新規機構：ラパマイシン結合タンパク質の真の役割
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20K05965
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
笠原 浩司 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (40304159)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志波 優 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (00647753)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | リボソームタンパク質遺伝子 / 出芽酵母 / 転写制御 / FKBP12 / ラパマイシン/FK506 / TORC1 / HMGBタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TORC1のFpr1結合サブユニットであるTor2に Fpr1との相互作用を失わせる変異を導入し、Fpr1の転写因子としての機能に対する影響を調べたところ、影響が見られなかったことから、Fpr1が転写因子として働く上で、TORC1との相互作用を必要しないことが明らかとなった。またFpr1にAIDデグロンを付加し、インドール酢酸の添加により細胞内のFpr1を速やかに分解する実験を通して、Fpr1の転写への影響が直接的なものであることも明らかにした。本申請の背景となる様々な成果に上記の結果を加え、国際的なジャーナルに論文を発表するとともに(PLOS Genetics,2020)、それに関連する総説一報を発表することができた(Current Genetics,2021)。
一方、本申請の計画に沿って、Fpr1と ①物理的、②機能的に相互作用する因子の探索を行った。①についてはFpr1全長をbaitにして、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行い、bait依存的にレポーター遺伝子の発現を促進する因子として、出芽酵母ライブラリーよりSED1、SiIM1などの遺伝子を同定した。同様のスクリーニングはツーハイブリッドアッセイの変法であるCytoTrap法によっても行った。②については、その転写がFpr1及びHmo1に強く依存する RPS24B遺伝子のプロモーターをHIS3遺伝子に繋いでhmo1Δfpr1Δ二重破壊株の染色体に挿入したレポーター株を構築し、適切な3ATを含むヒスチジン欠損株で生育不能な本株を用いて、マルチコピーサプレッサー及びサプレッサー変異株の単離を試みた。マルチコピーサプレッサーとしてGCN4、YAP1、VBA3等の遺伝子を同定し、現在それらによる生育回復の仕組みを調べている。サプレッサー変異株についても複数の変異株を単離済みで、今後はその変異遺伝子の同定を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本申請のバックグラウンドとなる成果について論文として発表することができた。その過程で本申請の研究計画をより鮮明にする事ができ、また論文化の追加実験の結果、申請における計画の一つについて結論を得ることができた。計画に記したFpr1と物理的、機能的に相互作用する因子の探索については、ともに複数の候補を同定することが出来、その中には目的としていたような因子に加え、逆に当初は全く予想していなかったような因子も含まれており、我々の研究の理解がより進むと同時に、研究が新しい方向に発展する可能性もある。
一方、 出芽酵母のFKBP12であるFpr1の転写因子としての機能が、他の真核生物でも保存されているかについても研究は進捗している。分裂酵母のFKBP12は、少なくともリボソームタンパク質遺伝子群を含め、染色体への結合は見られなかった。一方、出芽酵母でFpr1とともに働くHmo1についてはリボソームタンパク質への結合は見られなかったが、リボソームRNA遺伝子への結合がは観察された。現在、ヒト培養細胞、及び出芽酵母と近縁と考えられる病原性真菌Candida glabrataについて、FKBP12の遺伝子破壊及びFKBP12のChIP-seq解析のための免沈用タグの付加などを進めており、目的とする細胞の作製をほぼ完了している。今後はこれらの細胞株、菌株を用いて出芽酵母で行ったのと同様にRNA-seq、ChIP-seq、その他一連の解析を行い、これらの生物種のFKBP12が転写因子として働いているかの結論を得る。
このように研究に必要な材料や対象となる細胞などの作成は順調に進み、さらに既に成果が得られたものもあり、本申請の計画はおおむね順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画で、申請者が出芽酵母で見いだしたFKBP12の転写因子としての機能の真核生物における普遍性を調べるということを掲げ、ヒト培養細胞や分裂酵母を対象に研究を行って来た。今年度は引き続きそれを継続し、なるべく早い期間にその結論を得たいと考えているが、これらに加え、出芽酵母に進化的により近縁であると考えられている病原性真菌Candida labrataを同計画に加える。C.glabrataは、FKBP12タンパク質に加え、Hmo1、その他のリボソームタンパク質遺伝子群の転写因子についても、出芽酵母のオルソログとの類似性が高く、ヒトや分裂酵母に比べて、より出芽酵母に近い転写制御機構が動いていると可能性が高いと推察される。もしFKBP12やHmo1が関与する転写制御機構が、出芽酵母やC.glabrataなど一部の真菌類でのみ働いているのであれば、その仕組みを解明することにより、一部の病原性真菌に対する抗菌薬の有望な標的となることが期待される。そこで出芽酵母とC.glabrataのFKBP12、Hmo1その他の転写因子の機能的な互換性を調べるとともに、出芽酵母を対象として行ってきたChIP-seqやRNA-seqなどの解析手法をC.glabrataに適用し、本病原性酵母におけるFKBP12やHmo1の働きについて解析を行っていく。この研究に必要な菌株や遺伝子、及び遺伝子破壊株の多くは既に入手済みであるが、出芽酵母に比べて実験材料や実験手法などで確立していないことが多く、それらを整えながら2021年度内には一定の結論を得ることを目指す。
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| Causes of Carryover |
コロナのため、年度前半の多くの期間（4-8月）に申請者、及び研究分担者の大学への入構が制限され、研究の時間を十分にとれなかったことから、計画していた研究の一部を予定通り実施できず、次年度へ持ち越すことになった。今年度は計画していた実験を順次実施していく予定である。
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Research Products
(2 results)
