ゲノム編集を利用したリン酸飢餓耐性を持つイネの作出と遺伝子機能の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K05973
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 松本 隆 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (60370681)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: イネ / ゲノム編集 / リン酸吸収

Outline of Annual Research Achievements

本研究はイネに必須な元素であるリン資源の枯渇に対応するために、ゲノム編集技術を活用して、植物のリン酸のホメオスタシスを変更し、低リン酸条件でも生育するイネ突然変異体を作出することが目標である。昨年度はリン酸ホメオスタシスの制御因子の一つOsSPX1タンパク遺伝子をターゲットにし、ゲノム編集ベクターを構築してイネに導入し，ゲノム編集個体（T0個体）を得た。今年度はさらに追加の形質転換を行い，T0個体を139個体得た。このうち67個体についてSPX1の変異箇所を含む200bpの範囲をシーケンス解析した結果、2本鎖DNAの両方に同変異の挿入が確認されたホモ変異体（4）、2本鎖DNAの片方に変異の挿入が確認されたヘテロ変異体（32）、3つ以上の変異が確認されたモザイク個体（14）の3種類の変異が生じていた。変異が生じた個体は全体の75％を占め，再現性よくかなりの高効率で範囲が生じていることが分かった。ヘテロ及びホモ変異が生じた植物体を短日処理し稔実したT1個体について種子を確保した。
今年度はさらに別のゲノム編集ターゲットとしてOsNLA1を選択した。SPX1はリン酸不足に応じてリン酸輸送体・リン酸移動遺伝子を活性化する転写因子OsPHR2の転写活性をフィードバック阻害するタンパク質である。一方NLA1遺伝子はSPX1とは異なる経路で発現し，リン酸トランスポーターをユビキチン化し、プロテオソームによるトランスポーターの分解（推定）によるリン酸吸収の阻害を起こすことによって過剰なリン酸の吸収を抑える。OsNLA1遺伝子は6つのエクソンからなるが、最も5’端側の第1エクソンのタンパクをコードする配列内にPAM配列とOsNLA1遺伝子の20bp配列をgRNA発現ベクターに挿入し、バイナリーベクターと連結し、イネカルスを形質転換して、再分化個体111個体を作出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究期間の3年間でリン酸代謝遺伝子をゲノム編集したイネを作出し、機能解析を行って当該遺伝子の機能を明らかにする。初年度に続き本年度もSPX1のゲノム編集個体（T0）を追加して作成し、出穂後種子形成（T1種子）を得た。昨年度に引き続き、高効率で当該領域の変異がおきたことは、イネに対するCRISPR-Cas9の効率が高いことを示している。
また第2のゲノム変異ターゲットとしてOsNLA1のエクソンに対するゲノム編集を行い、再分化個体を得た。
当初の計画通り、イネのリン酸吸収に関する複数のゲノム編集個体の育成に成功した。

Strategy for Future Research Activity

1）OsSPX1遺伝子変異体について
OsSPX1のT1種子を生育させ、当該領域がホモ変異を生じた植物体について低リン酸培地で育成し、元の日本晴個体と比較しながら生育度合い・リン酸保持量の測定を行い、ゲノム編集が植物機能に与える影響を総括する。
2）OsNLA1遺伝子のゲノム編集T0個体について、ゲノム解析を行い、変異体と確認された個体を生育させ出穂した後T1種子を取得し、低リン酸培地で育成し、生育度合い・リン酸保持量の測定を行い、ゲノム編集が植物機能に与える影響を総括する。