2021 Fiscal Year Research-status Report
Development of genome editing technology to accelerate gene function analysis in the hexaploid sweet potato
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20K05984
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
門田 有希 岡山大学, 環境生命科学学域, 准教授 (30646089)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大谷 基泰 石川県立大学, 生物資源環境学部, 准教授 (20223860)
刑部 祐里子 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (50444071)
田淵 宏朗 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 九州沖縄農業研究センター, 上級研究員 (10355571)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 形質転換 / サツマイモ / 倍数性 / 線虫抵抗性 / 遺伝子機能解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、代表的な倍数性作物種であるサツマイモを対象に、遺伝子機能解析を加速させるためゲノム編集技術を開発する。最近、研究担当者らは、遺伝解析が極めて困難とされてきたサツマイモ（2n = 6x = 90）を対象にNGSを利用したゲノムワイドな遺伝解析を行い、さまざまな農業形質（線虫・ゾウムシ抵抗性、収量性や塊根の皮色等）にかかわるゲノム領域を同定した。さらに、トランスクリプトーム解析や全ゲノムリシーケンスのデータなども組み合わせることにより、線虫抵抗性ならびに塊根皮色を制御する候補遺伝子をそれぞれ1つに絞り込むことに成功した。しかしながら、これら候補遺伝子の機能解明には至っておらず、原因遺伝子であると証明されてはいない。遺伝子機能を詳細に調べるためには、その遺伝子を改変した植物体を作出する必要がある。
ゲノム編集はターゲット遺伝子をピンポイントで改変可能な技術であり、今後作物の効率的な品種改良には欠かせない技術となりうると考えられる。一方ゲノム編集の効率は植物細胞への遺伝子導入や植物体の再生効率に大きく影響を受ける。さらに植物は、倍数性や繁殖様式などの遺伝的特徴も異なる。よって、それぞれの植物種に適したツールの開発ならびに手法の確立が不可欠である。特にサツマイモについては形質転換の難易度が高く、６倍体で栄養繁殖性を示すため交雑育種や戻し交雑等である特定の遺伝子だけを取り除く、あるいは導入することが極めて難しい。そこで本研究では世界で７番目に生産量の多い重要作物であるサツマイモを対象にゲノム編集技術を開発し、遺伝子機能解析ならびに遺伝子改変した品種の効率的な育成に取り組む。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．線虫抵抗性候補遺伝子における原因変異の探索
形質転換を行う上では線虫抵抗性品種「ジェイレッド」の遺伝子配列情報が不可欠であるため、前年度に引き続き、遺伝子配列を詳細に解析した。抵抗性品種「ジェイレッド」と感受性品種「潮州」について遺伝子のアンプリコンを作製し、クローニング後、プライマーウォーキングで遺伝子全長配列を構築した。その結果、ジェイレッドではエクソン内部の60bpの欠失の有無により２種類のアレルが検出された。欠失のあるアレルはすべての機能ドメインが認識されたため、機能型アレルであると考えられた。一方、欠失のないアレルは機能ドメインが認識されず、非機能型アレルであると考えられた。潮州では機能型アレルは検出されなかった。
２．ジェイレッドの胚性カルスを用いた形質転換
昨年度、誘導に成功したジェイレッドの胚性カルスを使って遺伝子導入を試みた。5回の接種実験をおこなったところ、遺伝子導入が成功したと考えられるハイグロマイシン耐性カルスが77.8～94.8％の頻度で形成された。しかしながら、これらのハイグロマイシン耐性カルスからの植物体再生にはこれまでのところ至っていない。
３．花らんまんの胚性カルスを用いた形質転換
常法に従って誘導した花らんまんの胚性カルスを使って、ジェイレッドの機能型配列および非機能型配列、潮州の非機能型配列、目的遺伝子を挿入していないpZH2Bの導入実験をおこなった。これまでにジェイレッド非機能型配列は107個、ジェイレッド機能型配列は45個、潮州非機能型配列は18個、目的遺伝子を挿入していないpZH2Bは27個のカルスへアグロバクテリウム菌の接種実験をおこなった。現在、一部の接種処理をした胚性カルスからハイグロマイシン耐性カルスが形成され始めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究結果より、抵抗性と感受性品種間で遺伝子配列に違いが検出された。また予備的な実験によりジェイレッドのプロモーター領域で特異的に複数のcis配列が確認されたため、いずれかのcis配列が候補遺伝子の発現制御に関与していることも示されている。しかしながら、遺伝子内部の60bp の欠失が抵抗性に寄与するのか、それともプロモーター領域のcis配列の違いで生じる発現量の差で抵抗性が発揮されるのかについては不明である。そこで、機能型アレル（60bpの欠失無し）と非機能型アレル（60bpの欠失有り）を過剰発現させた形質転換体を作出し、線虫接種試験を行い、抵抗性程度を評価する。サツマイモの形質転換実験は時間を要するため、トマトを使った形質転換実験も並行して行う。また、プロモーター領域のcis配列の影響を調べるため、Nativeプロモーターを導入した個体も作出し、抵抗性程度に違いがあるかも調査する。
具体的にはトマトあるいはサツマイモの「花らんまん」を用いて35Sプロモーターで機能型・非機能型アレルを過剰発現させた形質転換体を作出する。得られた形質転換体については導入した遺伝子の発現量を調査するとともに、線虫の接種試験を行い、抵抗性程度を評価する。一方、ジェイレッドを用いた形質転換実験ではハイグロマイシン耐性カルスからの植物体再生には至っていない。これは遺伝子導入が成功した細胞が胚性カルス形成能を何らかの理由によって消失したことによるものであると考えられる。そのため、今後、培養した茎頂組織が胚性カルスを形成する初期段階である胚性カルスと不定胚が混在する状態の培養物を遺伝子導入実験の対象にすることを検討する予定である。ジェイレッドでの再分化が可能となれば、RNAi法により抵抗性遺伝子の発現量を抑制した個体、あるいはゲノム編集により抵抗性遺伝子をノックアウトした個体を作出する。
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| Causes of Carryover |
今年度は形質転換用コンストラクトの作製作業に予想以上の時間がかかった。そのため、機能解析用の経費がかからず残高が生じたため、次年度に繰り越すこととした。現在、遺伝子導入を進めており、機能解析は今年度中に実施する予定であることから、研究プロジェクト遂行には問題ないと思われる。
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Research Products
(2 results)
